Summary
방광 종양은 catheterization, 지역 소작하고, 화상 사이트에 암종 세포의 후속 유착을 통해 법으로서 방식으로 여성의 생쥐에 설립되었습니다.
Abstract
이 간단한 절차에서 방광 종양이 catheterization의 사용, 지역 소작하고, 이후 세포 접착을 통해 여성 C57 생쥐에서 설립되었습니다. 그들의 bladders가 transurethrally catheterized과 탈진 후, 동물 다시 요도 또는 방광을 손상시키지 않고 bladders에 백금 와이어의 삽입을 허용하는 catheterized 있습니다. 카테터는 화상 상해를 만들 방광에 전류를 실시 와이어에 대한 절연체 역할을 테플론의 만들어집니다. electrocautery 단위는 세포 레이어를 멀리 레코딩 및 후속 catheterization 통해 방광에 정지에 전달됩니다 암종 세포에 대한 첨부 파일 사이트를 제공하는 전선의 노출 끝에 2.5W 전달하는 데 사용됩니다. 세포는 카테터를 제거하고 bladders가 자연스럽게 배수 수있는 후 90 분 동안 방광에 남아 있습니다. 종양의 발달은 초음파를 통해 모니터링됩니다. 특정주의는 함께 동영상 catheterization 기술로 지급됩니다.
Protocol
1. 동물
- 여성 C57BL/6J 생쥐 (뮤스 musculus)는 전에 출하하는 공급 업체에 의해 17 murine 바이러스 전염성 ectoparasites, 기생충 endoparasites 및 항체 무료로 확인됩니다. 마우스는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 안내에 따라 툴란 대학의 AAALAC - 공인 동물 시설에 보관되어있다. 1
- 특히, 마우스는 나무 침구 개별적으로 통풍 폴리 카보 네이트 cageswith의 microisolation 필터 정상에 보관되어 그룹 (4-5 마우스 / 케이지)입니다. 그들은 광고 libitum pelleted 쥐 음식과 수돗물을 제공하고 있습니다.
- 생쥐는 칠일은 연구의 시작하기 전에 적응을 사용할 수 있습니다.
2. 셀
- murine 전환 세포 암종 세포 라인 MB49은 방광 종양을 생산하는 데 사용됩니다.
- 세포 10% 태아 소 혈청, 100 단위 / ML 페니실린, 100 단위 / ML 스트렙토 마이신과 보충 Dulbecco의 수정 이글의 중간에있는 양식입니다.
- 문화가 37 ° C 유지 및 매체와 CO 2 2 ~ 3 일마다 변경 5 %.
3. 동물 Orthotopic 종양 모델
방광 종양 모델 여기서 설명의 기지는 군터 외에 의해 설명하는 절차를 수정합니다. 2
- 마취는 산소 isoflurane 2% (MWI / VetOne, 메리디언, ID, 고양이 # 501017)를 유도하고 0.75-1.25 %에서 관리하고 있습니다. (여러 동물 isoflurane 수준의 증가 할거 것이되는, 동시에 처리하실 수 있습니다.) 각막 건조를 방지하기 위해, 눈이 인공 눈물 안과 연고와 윤활 있습니다. 체온은 종이 드레이프 아래 온수 패드로 유지됩니다.
- 허리의 모피는 금속 접지 플레이트와 접촉을 추진 잘린이며, 면도 지역 electroconduction 젤로 코팅됩니다.
- 각각의 마우스는 다음 개별적으로 금속 접지 판에 지느러미 recumbancy에 배치되고 방광은 transurethrally, 4분의 3 인치 이상 - 더 - 바늘 IV 카테터가 제거 탐침과 윤활 24 게이지를 사용하여 catheterized 있습니다.
- 방광은 소변의 탈진 상태이며, 백금 와이어는 카테터의 각 끝에 노출된 전선을 떠나 방광에 카테터를 통해 삽입됩니다 - 카테 테르의 lumenal 끝에 약 2mm. 와이어는 백금의 산화로 인해 소재의 저항 이루어집니다.
- 2.5 W 전류는 다음 응고로 설정 electrocautery 장치와 와이어의 외관 부분을 만져 약 0.5 초에 대한 방광에 적용됩니다.
- 와이어는 다음 방광에서 두 번째 위치와 다른 적용 2.5 W 요금으로 이동됩니다.
- 와이어가 제거하고, / ML은 1ml 주사기를 통해 방광에 카테터를 통해 얻은 것입니다 1x10 6 세포의 농도에서 세포 MB49 100 μl입니다.
- 주사기는 세포 suspensions의 유출을 방지하기 위해 카테터에 연결된, 그리고 catheterized 생쥐는 세포가 화상 사이트에 연결할 수 있도록 90 분 정도 마취 유지됩니다 남아 있습니다.
- 멸균 생리의 정상 100-200 μl는 복구하기 전에 각 마우스 IP 주사로 관리합니다.
- 잠복기의 끝에 카테터가 제거되고 righting의 반사 신경은 생쥐가 자신의 집에서 연습장에 반환되는 시점에서 돌아올 때까지 동물은 온수 패드에 복구할 수 있습니다.
4. 초음파
- 종양은 생쥐는 종양 성장을 모니터링하는 방광의 초음파 검사를 받아야하기 전에 3~5일에 대한 성장을 사용할 수 있습니다.
- 위에서 설명한 초기 초음파 시험, 동물 anesthetized 있습니다. 생쥐는 지느러미 recumbancy에 배치하고 있으며, 복부 피부는 모피를 클리핑하여 준비가되어 있습니다.
- 24 게이지 IV 카테터가 방광에 transurethrally 삽입됩니다. 이 시점에서, 방광은 탈진 상태와 소변 추가 분석을 위해 수집하실 수 있습니다.
- 무균 정상 생리를 100 μl은 초음파에서 방광의 가시성을 향상을 위해 카테터를 통해 방광으로 얻은 것입니다.
- 초음파 전도 젤은 복부에 적용되며, 초음파 검사는 방광 벽 및 루멘을 평가하기 위해 수행됩니다.
5. 대표 결과 :
종양 조직은 innoculation 후 3-5일 표시됩니다. 일 5 시까지 - 우리의 경험에서는, 12 마우스의 그룹에 더 정기적으로 50 %가 (1.0 μl, V = π / 6 · L ° W · H를 사용하여 0.5) 방광 내에 감지 조직 질량 있습니다. 메가바이트 49 세포를 사용하는 경우 종양 성장을 계속하고 쥐가 치료 가면 안락사는 24 일 필요로합니다. 쥐가 기면 또는 cachectic 될 때 안락사를 권장합니다, 쓸 모피, hunching, 비 응답 행동하거나 그들의 초기 체중의 20 %를 잃게됩니다. <를 표시/ P>
종양은 빠르게 성장하고 개발 종양의 세포가 빨리 angiogenic 혈액 공급에 의해 서비스를 수있는 것보다 분아 따위에 의해 번식하기 때문에 그들이 표면상 200 MG 이상 3의 질량에 도달 후 괴사성 센터됩니다. 하나는 간접적으로 아마도 개발 종양 내에 급속한 angiogenesis 관련되어 hematurea의 수준을 통해 종양 진행을 모니터할 수 있습니다. 그것은 일관되게 치료 종양 베어링 생쥐의 소변은 14 일 혈액을 포함 있다고 언급했다. 적혈구의 농도는이 생쥐에서 시간이 지남에 따라 증가 등장하고, 소변의 볼륨이 감소 수집했습니다. 50 MG 초과 종양은 또한 일반적으로 십사일 게시물 innoculation에 의해 상대적으로 쉽게 palpated 수 있습니다.
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Discussion
서로 다른 결과가 예상해야하지만, 여성의 생쥐에 orthotopic 방광 종양 수립이 법으로서 방법, MB49 이외의 셀 유형에도 적용할 수 있습니다. 덜 공격적인 종양 세포를 사용하는 경우 (새로운 최적을 수립 0.5 W 단위 사용) 약간 와트 증가하면 종양 세포 부착에 더받을 수있는 영역을 낼 것이며, 얻은 세포에 대한 더 이상 방광 배양 시간은 큰 금액을 낼 것입니다 화상 사이트 (게시되지 않은 데이터)에 세포 부착. 일부 프로토콜 electrocautery, 2를 통해 10 W를 제공하는 것이 좋습니다 있지만 전력이 금액은 상한 고려되어야하고, 아마 모두 피할 수 있습니다. 다른 세포 유형을 사용하는 경우 제공 세포의 농도를 증가하면 성공의 가능성을 높일 수 있습니다.
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Disclosures
동물 실험 툴란 대학의 기관 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 경력 수상 (CBET - 0846395)과 비교 의학의학과 툴란 대학에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-5-wk-old |
| Polycarbonate cages and ventilated rack | Lab Products | Super Mouse 750 | 327mm x 190mm x 143mm |
| Hardwood Bedding | Harlan Laboratories | Laboratory –grade SaniChips | |
| Rodent diet | Harlan Laboratories | Rodent Diet 2019 | |
| IV Catheter | MWI Veterinary Supply | 009231 | 24 G x ¾ in. |
| Electrocautery unit | Bovie Medical Corporation | Aaron 900 | |
| Ultrasound unit | Sonosite | 180 Plus (Vet) | |
| MB49 cell line | Wake Forest University Baptist Medical Center | N.A. | |
| DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100106 500A57B | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-163 |
References
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
