Summary
Los tumores de vejiga se establecen en las hembras de una forma mínimamente invasiva a través de cateterismo, la cauterización local, y posterior adhesión de las células cancerosas a los sitios de quema.
Abstract
En este sencillo procedimiento, los tumores de vejiga se establecen en las mujeres ratones C57 a través del uso de la cateterización, la cauterización local, y la adhesión celular posterior. Después de su vejiga está transuretral sondaje y drenaje, los animales son una vez más por sondaje para permitir la inserción de un alambre de platino en la vejiga sin dañar la uretra o la vejiga. Los catéteres están hechos de teflón para servir como aislante para los cables, que conducen la corriente eléctrica en la vejiga para crear una lesión por quemadura. Una unidad de electrocauterio son utilizados para entregar 2,5 W para el extremo expuesto del cable, quemando capas extracelular y proporcionar sitios de unión de las células de carcinoma que se entregan en la suspensión de la vejiga a través de un cateterismo posterior. Las células permanecen en la vejiga durante 90 minutos, tras lo cual los catéteres se retiran y la vejiga se deja escurrir de manera natural. El desarrollo de tumor se controla a través de ultrasonido. Se presta especial atención a la técnica de cateterismo en el video que lo acompaña.
Protocol
1. Los animales
- Ratones hembra C57BL/6J (Mus musculus) se verifican libres de ectoparásitos contagiosa, endoparásitos helmintos, y los anticuerpos a 17 virus murinos por el proveedor antes del envío. Los ratones se encuentran en las instalaciones de animales AAALAC acreditado por la Universidad de Tulane, de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 1.
- En concreto, los ratones son alojados en grupo (4-5 ratones / jaula) en forma individual con ventilación tapas de policarbonato microaislamiento cageswith filtro de cama de madera dura. Se les proporciona alimentación ad libitum de roedores granulado y el agua del grifo.
- Los ratones se les permite de 7 días para aclimatarse antes del inicio del estudio.
2. Las células
- El carcinoma de células transicionales murino línea celular MB49 se utiliza para producir los tumores de vejiga.
- Las células se cultivaron en medio Dulbecco modificado de Eagle suplementado con suero fetal bovino al 10%, 100 unidades / ml de penicilina, y 100 unidades / ml de estreptomicina.
- Cultivos se mantienen a 37 º C y 5% de CO 2 con los medios de comunicación cambia cada dos o tres días.
3. Animales modelo de tumor ortotópico
La instilación de la modelo de tumor de vejiga se describe aquí es una modificación del procedimiento descrito por Gunther et al 2.
- La anestesia se indujo con 2% de isoflurano (MWI / VetOne, Meridian, ID, Cat. # 501017) en el oxígeno y se mantiene en 0,75-1,25%. (Varios animales pueden ser tratados al mismo tiempo, lo que exigiría un aumento en los niveles de isoflurano.) Para evitar que se seque la córnea, los ojos están lubricados con un ungüento oftálmico lágrimas artificiales. El calor del cuerpo se mantiene con un cojín calentado bajo una cortina de papel.
- La piel de la espalda baja se recorta para promover el contacto con la placa de puesta a tierra de metal, y la zona de afeitado está recubierta con gel electroconduction.
- Cada ratón se colocan individualmente en recumbancy dorsal sobre una placa de metal a tierra, y la vejiga se sondaje transuretral con un lubricado de calibre 24, 3 / 4 pulgadas, el exceso de la aguja del catéter IV con el estilete eliminado.
- La vejiga urinaria se vacía de orina, y un alambre de platino se inserta a través del catéter en la vejiga urinaria dejando el cable expuesto en cada extremo de la sonda - de aproximadamente 2 mm en el extremo de la luz del catéter. El cable es de platino debido a la resistencia del material a la oxidación.
- Una corriente de 2,5 W se aplica luego a la vejiga durante aproximadamente 0,5 segundos al tocar la parte exterior del cable con una unidad de electrocauterio establecido en la coagulación.
- El alambre se mueve entonces a un segundo lugar en la vejiga y otra carga de 2,5 W aplicada.
- Se retira el alambre, y 100 l de MB49 células a una concentración de 1x10 6 células / ml se inculca a través del catéter en la vejiga a través de una jeringa de 1 ml.
- Las jeringas son colocada en los catéteres para evitar flujo de salida de las suspensiones celulares, y los ratones sondaje se mantienen bajo anestesia durante 90 minutos para permitir que las células se unen a los sitios de quema.
- 100-200 l de solución salina normal se administra por inyección IP a cada ratón antes de la recuperación.
- Al final del período de incubación de los catéteres se retiran y los animales se les permitió recuperarse en el teclado se calienta hasta reflejos de enderezamiento vuelta, momento en el que los ratones son devueltos a sus jaulas.
4. Ultrasonido
- Los tumores se dejaron crecer durante 3-5 días antes de los ratones someterse a un examen de ultrasonido de la vejiga urinaria para monitorizar el crecimiento del tumor.
- Para los exámenes de ultrasonido inicial, los animales son anestesiados como se describió anteriormente. Los ratones se colocan en recumbancy dorsal, y la piel del abdomen se prepara recorte de la piel.
- Un catéter de calibre 24 IV se inserta en transuretral de la vejiga urinaria. En este punto, la vejiga puede ser drenado y la orina recogida para su posterior análisis.
- 100 l de solución salina estéril se instila en la vejiga a través del catéter para mejorar la visibilidad de la vejiga en la ecografía.
- Gel para ultrasonido de conducción se aplica en el abdomen y la ecografía se realiza para evaluar la pared de la vejiga y de la luz.
5. Los resultados representativos:
Tejido del tumor comienza a aparecer 3-5 días después de la inoculación. En nuestra experiencia, en un grupo de 12 ratones, 50% o más habitualmente tienen una masa de tejido detectable dentro de la vejiga (0,5 hasta 1,0 l, con V = π / 6 · L · W · h) por cinco días. Cuando se utiliza MB 49 células, los tumores seguirá creciendo y la eutanasia debe ser enviado hasta el día 24 si los ratones sin tratar. La eutanasia se recomienda cuando los ratones se letárgico o caquexia, la pantalla de pieles erizadas, encorvado, y el comportamiento no responde, o cuando pierden el 20% de su peso corporal inicial. </ P>
Que los tumores crecen rápidamente y tienen centros de necrosis después de llegar a una masa de 200 mg o más, 3 ostensiblemente porque las células en el tumor en desarrollo proliferan más rápido de lo que puede ser reparado por el suministro de sangre angiogénico. También se puede controlar indirectamente la progresión del tumor a través del nivel de hematurea, que está presumiblemente relacionada con la angiogénesis en los tumores de rápido desarrollo. Se observó consistentemente que la orina de tratar ratones con tumores restos de sangre el día 14. La concentración de los glóbulos rojos parece aumentar con el tiempo en estos ratones, y los volúmenes de orina recogida disminuido. Los tumores de más de 50 mg también se puede palpar con relativa facilidad, por lo general por 14 días después de la inoculación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este método mínimamente invasivo para el establecimiento de los tumores de vejiga ortotópica en ratones hembras también se puede aplicar a otros tipos de células de MB49, a pesar de los diferentes resultados se deben anticipar. Al menos agresiva células tumorales se utilizan, aumentando ligeramente la potencia (con incrementos de 0,5 W para establecer el nuevo óptimo) rendirá un área más susceptible a la conexión de las células tumorales, y los tiempos de incubación de la vejiga para que las células inculcado dará lugar a una mayor cantidad de celular apego a los sitios de quemar (datos no publicados). Aunque algunos protocolos se establece la entrega de 10 W a través de electrocauterio, 2 esta cantidad de energía se debe considerar un límite superior, y tal vez evitarse por completo. El aumento de la concentración de células entregó también puede aumentar las probabilidades de éxito cuando otros tipos de células se utilizan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el cuidado institucional y el empleo de la Universidad de Tulane.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el premio Nacional de Ciencias CARRERA Foundation (CBET-0846395) y el Departamento de Medicina Comparada, Universidad de Tulane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-5-wk-old |
| Polycarbonate cages and ventilated rack | Lab Products | Super Mouse 750 | 327mm x 190mm x 143mm |
| Hardwood Bedding | Harlan Laboratories | Laboratory –grade SaniChips | |
| Rodent diet | Harlan Laboratories | Rodent Diet 2019 | |
| IV Catheter | MWI Veterinary Supply | 009231 | 24 G x ¾ in. |
| Electrocautery unit | Bovie Medical Corporation | Aaron 900 | |
| Ultrasound unit | Sonosite | 180 Plus (Vet) | |
| MB49 cell line | Wake Forest University Baptist Medical Center | N.A. | |
| DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100106 500A57B | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-163 |
References
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
