Summary
Здесь мы опишем метод эффективно расширить и очистить большое количество человеческих NK клеток и оценить их функцию.
Protocol
1. Выделение МНПК от Баффи Coat
Мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) получаются плавучей центрифугирования плотности на Ficoll-Paque от здоровых доноров лейкомассы образцы полученных лейкафереза.
- Ficoll-Paque центрифугирования делается как протокол на одного производителя с незначительными изменениями.
- Добавить PBS к нормальной донорской крови-банк лейкомассы до конечного объема 140 мл (типичное пальто Баффи объем 40-70 мл).
- Слой 35 мл образца пальто Баффи на 15 мл Ficoll-Paque (4 трубы).
- Центрифуга при 400g в течение 20 минут без тормозов.
- Восстановление МНПК от Ficoll-Paque: плазма интерфейс, не выбрасывайте эритроцитов на дне Ficoll-Paque.
- Вымойте МНПК три раза PBS, центрифугирования каждый раз при 400g в течение 10 минут.
- МНПК могут быть использованы непосредственно для НК расширения ячейки на этом этапе или NK клетки могут быть выделены путем RosetteSep (раздел 4)
- Оставшиеся МНПК могут быть заморожены в ФБС, содержащего 10% ДМСО в жидком азоте.
- Аспирируйте Ficoll и собирать эритроциты, начиная с шага 5 на две трубки центрифуги 50 мл, мыть три раза PBS (добавляют к 50 мл отметки), каждый раз аспирата супернатант скимминга верхней части слоя РБК удалить гранулоцитов.
- Эритроциты могут быть использованы непосредственно для RosetteSep очистки НК-клеток (см. раздел 4) или храниться в равном объеме решение Alsever это при 4 ° C для дальнейшего использования (эритроциты можно хранить в течение не более 4 недель).
2. Н. К. сотовый расширения
Расширение NK клетки может быть начато использование МНПК или очищенной NK клеток. Количество МНПК использоваться для расширения может варьироваться в зависимости от количества НК клетки желаемого в конце трехнедельного расширения, обратитесь к представителю результаты разделе. (См. примечание 1)
СТИМУЛЯЦИЯ 1
День 0
- Для каждого 5x10 6 МНПК быть расширен, считать и облучать 10x10 6 К562 CL9 mIL21 с помощью гамма-облучатель при 100 Гр.
- Сообщение облучения, мыть клетки с PBS и ресуспендируют в НК ячейки расширения носителя (NKEM).
- Семенной 5x10 6 МНПК с 10х10 6 облученных К562 CL9 mIL21 (1:2) в 40 мл NKEM в T75 колбу и поместить его в вертикальном положении в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
Дни 3 и 5
- Восстановление клетки центрифугированием при 400g в течение 5 мин и заменить половину средств массовой информации со свежими NKEM (добавление свежей Ил-2 для всего объема средств массовой информации) и продолжить культуры.
СТИМУЛЯЦИЯ 2
День 7
- Подсчитайте количество клеток в культуре в конце недели.
- Отложите 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии (см. примечание 2)
- Для каждого 5x10 6 ячеек, которые будут restimulated, считать и облучать 5x10 6 К562 CL9 mIL21 с помощью гамма-облучатель при 100 Гр.
- Добавить равное количество облученных К562 CL9 mIL21 (1:1) и ресуспендируют в NKEM на 2.5x10 5 всего клеток / мл (см. Примечание 3).
- Семенной клеток в колбах T75 (максимум 50 мл на флакон).
Дни 10 и 12
- Подсчитайте количество клеток.
- Изменение всей СМИ со свежими NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3).
День 14
- В конце две недели расширения подсчета количества клеток в культуре.
- Отложите 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии (см. примечание 2)
- Если экспансия началась с МНПК NK клетки могут быть очищены на данном этапе расширение с помощью протокола RosetteSep очистки (см. раздел IV). Если расширение началось из очищенных натуральных киллеров переходите к стимуляции 3.
- После очистки отложить 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии для проверки чистоты NK клеток (как в шаге 8).
- Приступить к стимуляции 3, используя все очищенные клетки NK (См. примечание 4).
СТИМУЛЯЦИЯ 3
- Ресуспендируют NK клеток с облученным К562 CL9 mIL21 (1:1) в NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3).
Дни 17 и 19
- Подсчитайте количество клеток.
- Изменение СМИ со свежими NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3).
День 21
- По истечении трех недель расширения подсчета количества клеток в культуре.
- Восстановление 1x10 6 клеток для анализа потока цитометрии для полного ячейки NK панели антител фенотипирование (см. Таблицу 1).
- Замораживание клеток в ФБС, содержащий 10% ДМСО при максимальной плотностью 5х10 7 клеток на флакон для будущего использования.
3. Н. К. сотовый Цитотоксичность Пробирной
- Оттепель флакон НК-клеток и семян NKEM, за день до ЧПrforming цитотоксичность анализа, чтобы восстановление.
- Для каждого НК анализа цитотоксичности клеток с использованием одной линии клеток-мишеней, 6x10 5 NK клеток и 3х10 5 клеток-мишеней не требуется (см. примечание 5).
- Подготовка CAM-Медиа путем разбавления кальцеин-AM (акции 1 мг / мл в ДМСО) в NKEM (См. примечание 6).
- Ресуспендируют 10 6 клетки-мишени в 1 мл CAM-медиа (см. Примечание 7).
- Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° C, при периодическом встряхивании.
- Ресуспендируют NK клеток на 1x10 6 клеток / мл и добавить 200uL НК клеточной суспензии для каждого из 3 скважин U-дно 96-луночного планшета соответствующие до 10: 1 E: T соотношение показано на рисунке 1. (См. Примечание 8)
- Добавить 100 мкл полной СМИ, чтобы все оставшиеся лунки за исключением "Максимум".
- Добавить 100 мкл 2% Тритон Х-100 на "Максимум".
- Выполните серийные разведения NK клеток для последующей 5 E: T отношений путем передачи 100 мкл клеток каждый раз, хорошо перемешать. Отменить 100 мкл из последних скважин (E: T отношение 0.3125:1).
- Через 1 час загрузки кальцеин, мыть клетки-мишени в NKEM дважды, центрифугирования в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту. (См. Примечание 9)
- Пересчет клеток-мишеней и ресуспендируют в 1х10 5 клеток / мл.
- Добавить 100 мкл клеток-мишеней в каждую лунку (1x10 4 / а). Центрифуга в течение 1 мин на 100 г инициировать ячейки контакта.
- Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 4 часов.
- Смешайте культуры осторожно с помощью пипетки с 100 мкл pipetter для того, чтобы равномерно приостановить выпущен кальцеин, замедления вращения пластины на 100 г в течение 5 минут для осаждения клеток и передачи 100 мкл надосадочной к новой пластинкой заботясь, чтобы избежать пузырей. Поп пузыри, которые могут форму с помощью тонкой иглы.
- Прочитано пластины с использованием флуоресцентных читателя пластины (возбуждение фильтра 485 нм, эмиссия фильтр 530 нм). Нижняя читать рекомендуется.
- Рассчитать процент Конкретные Лизис по формуле [(тестовый релиз-спонтанное выделение) / (максимальное релиз - спонтанное выделение)] х 100.
4. Н. К. сотовый Очистка RosetteSep
- Возьмите 100-кратного избытка эритроцитов, что и МНПК или расширенных клеток, в 50 мл трубки (100:1 РБК: МКПК).
- Если вы используете свежие эритроциты приступить непосредственно к следующему шагу, или если эритроциты хранились в растворе Alsever с, подсчитать количество эритроцитов и промыть соответствующий (100-кратного избытка) количество эритроцитов с PBS с добавлением 2% ЭТС три раза, центрифугирования при 1200 оборотов в минуту в течение 10 минут каждый раз.
- Комбинат эритроцитов с МНПК с шагом 1,7 или расширенных клетки шагом 2,10 в PBS + 2% ЭТС для конечного объема 1 мл на 5x10 7 из МНПК или расширенных клеток.
- Добавить 1 мкл из RosetteSep человеческих клеток NK обогащению Коктейль на 1x10 6 из МНПК или расширенных клеток.
- Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут с нежным смешивания каждые 5 минут.
- Добавить равным объемом PBS + 2% смеси FBS мягко и слой поверх Ficoll-Paque.
- Повторите шаги Ficoll-Paque центрифугирования описано для изоляции РВМС (раздел I).
- Граф Н. К. клетки восстановились после очистки и отложите 5x105 клеток для phenotpying методом проточной цитометрии для НК ячейки чистоты (Шаг 8).
5. Примечания
ПРИМЕЧАНИЕ 1. НК-клеток может быть расширен непосредственно из МНПК, или от RosetteSep очищенной NK клеток. Мы отметили, аналогичные эффективность расширения, но некоторые доноры могут иметь очень низкие НК номера сотовых в результате чего трудности очистки от RosetteSep до расширения.
ПРИМЕЧАНИЕ 2. Мы обычно используют CD56-FITC, CD16-PE и CD3-PE-Cy5 для фенотипирование в ходе расширения, перечисляя НК-клеток, как те, которые CD3-отрицательных и CD16-CD56 или-положительными.
ПРИМЕЧАНИЕ 3. При каждом изменении СМИ или стимуляции, ресуспендирования клеток в 2,5 х 10 5 / мл держать РВМС / NK на номера сотовых или менее 2 миллионов на мл на пике стадии расширения. Это позволит предотвратить истощение питательных веществ и помочь в достижении максимального расширения и выживания.
Примечание 4. НК скорость расширения доноров зависимых и в конце стимуляции 1 или 2 части клетки могут быть заморожены, а часть еще больше расширить в зависимости от экспериментальных нужно. У нас были хорошие успехи в использовании замороженных клеток для разложения на более позднее время.
ПРИМЕЧАНИЕ 5. В целях обеспечения права на ошибку мы рекомендуем использовать не менее 7х10 5 NK клетки ресуспендировали в 700 ULS из NKEM и 4x10 5 кальцеин-АМ окрашенные клетки-мишени ресуспендировали в 4 мл NKEM для создания цитотоксичность анализа. При использовании многоканальной пипетки для посева клеток-мишеней больших объемов ячеек (до 6x10 5 в 6 мл) могут потребоваться в зависимости от размера средств массовой информации бассейна используется. Также рекомендуется НК номера сотовых специально для E: T отношения шоу в протокол, для использования более высоких E: T соотношение увеличенияНК номера сотовых на мл соответственно (например, для 40:1 E: T соотношение использования 4x10 6 клеток / мл)
ПРИМЕЧАНИЕ 6. Рекомендуется выполнять предварительные кальцеин-АМ загрузки титрования для линии клеток-мишеней выбора, используя следующие разведения 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 и 1:100 для достижения оптимальной разницу между максимальной и спонтанное освобождение.
ПРИМЕЧАНИЕ 7. При использовании приверженцем клеточной линии, как цель, сначала подготовить суспензии отдельных клеток с использованием не-ферментативной клеточной диссоциации буфера. При выполнении ADCC, готовят дубликаты трубки клеток-мишеней в CAM-медиа.
ПРИМЕЧАНИЕ 8 При выполнении ADCC, добавить же NK клетки 3 скважины соответствующей 10:01 E:. Т для ADCC. Повторите эти действия для дополнительных доноров. Повторите эти действия для дополнительных клеток-мишеней.
Примечание 9. При выполнении ADCC эксперимента, после 45 минут загрузки кальцеин, добавьте 10ug из антител, специфичных для стимулирования ADCC против клеток-мишеней. После 15 минут, промойте клетки-мишени в полной среде в два раза, центрифугирования в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту. Ресуспендируют клеток 1х10 5 клеток / мл и приступить к следующему шагу в протокол.
6. ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РЕЗУЛЬТАТЫ
Рисунок 2. Когда расширение выполняется согласно схеме, описанной выше, с использованием 5x106 МНПК в качестве исходного материала, типичные НК клетка дает диапазон от 1x10 9 до 10 10 клетки (донора зависимыми изменчивость). На рисунке показана НК ячейки раза расширения (п = 19) по сравнению с НК клетки, присутствующие в оригинальный продукт (средний + / - квартиль).
Рисунок 3. Расширены клетки NK выражения различных NK-клеточных рецепторов, которые сопоставимы с невспененные первичной NK клеток с несколькими исключениями (CD11b, CD160 и CD244).
Рисунок 4. МНПК восстановление после Баффи пальто доноров зависимым и может варьироваться от 6 до 300x10 800x10 6. NK клетки могут включать в себя 2% - 18% МНПК. Для очистки RosetteSep расширенного клеток, восстановления чистых натуральных киллеров на 14 день составляет от 40-70%. Следуя рекомендуется протокол расширения и очистки, Н. К. чистоты ячейка 99% можно ожидать.
Рисунок 5. Расширенное НК-клеток показали, цитотоксичности против ряда опухолевых клеточных линий, включая нейробластома, борьбы с отмыванием денег, остеосаркома и меланома (представительных AML убийство показано в процентах конкретных лизис).
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Лоуренса Купер, Harjeet Сингх, и Ленка Hurton за их работу по созданию начальной К562 AAPC и mIL21 векторов синтеза.
Финансирование этих работ было предоставлено UT MD Anderson врач ученый Программа, Фонд святого Baldrick, и легенды Friendswood.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM) |
|||
| 90% RPMI 1640 | Cellgro | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| 1x Penicillin / Streptomycin | Cellgro | ||
| 1x L-Glutamine | Gibco | Filter Sterilize media before use. | |
| 50 U/ mL IL2 | Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc) | Diluted from a 200 IU/μl stock. Add IL2 to desired amount of media just before use each time. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
PBMC and NK Cell Isolation |
|||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | ||
| Alsever's solution | Sigma) | ||
| RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail | Stemcell Technologies) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
NK Cell Cytotoxicity Assay |
|||
| Calcein-AM | Invitrogen | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies |
|||
The list of antibodies used for NK cell phenotyping are listed in table below: |
|||
Tube 1: (total volume 100) |
|||
| Antibody: Isotype FITC | BD Pharmingen | 555748 | Volume: 5 |
| Antibody: Isotype FITC | BD Pharmingen | 555749 | Volume: 5 |
| Antibody: Isotype FITC | BD Pharmingen | 557224 | Volume: 5 |
| Antibody: Isotype FITC | BD Pharmingen | 340442 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 80 | |
Tube 2: (total volume 100) |
|||
| Antibody: CD56 FITC | BD Pharmingen | 340410 | Volume: 5 |
| Antibody: NKp30 PE | BD Pharmingen | 558407 | Volume: 5 |
| Antibody: NKp44 PE | BD Pharmingen | 558563 | Volume: 5 |
| Antibody: NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | Volume: 5 |
| Antibody: CD3 PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555341 | Volume: 5 |
| Antibody: CD16 Alexa 647 | BD Pharmingen | 557710 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 70 | |
Tube 3: (total volume 100) |
|||
| Antibody: CD56 FITC | BD Pharmingen | 340410 | Volume: 5 |
| Antibody: KIR2DL1 PE | R&D Systems | FAB1844P | Volume: 5 |
| Antibody: KIR2DL2/3 PE | Miltenyi Biotec | 130-092-618 | Volume: 5 |
| Antibody: KIR3DL1 PE | R&D Systems | FAB12251P | Volume: 5 |
| Antibody: CD3 PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555341 | Volume: 5 |
| Antibody: NKG2D APC | BD Pharmingen | 558071 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 70 | |
Tube 4: (total volume 100) |
|||
| Antibody: CD56 FITC | BD Pharmingen | 340410 | Volume: 5 |
| Antibody: CD11b PE | BD Pharmingen | 555388 | Volume: 5 |
| Antibody: CD3 PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555341 | Volume: 5 |
| Antibody: CD27 APC | BD Pharmingen | 558664 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 80 | |
Tube 5: (total volume 100) |
|||
| Antibody: CD56 FITC | BD Pharmingen | 340410 | Volume: 5 |
| Antibody: CD266 (DNAM-1) PE | BD Pharmingen | 559789 | Volume: 5 |
| Antibody: CD3 PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555341 | Volume: 5 |
| Antibody: CD160 Alexa647 | eBiosciences | 51-1609-42 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 80 | |
Tube 6: (total volume 100) |
|||
| Antibody: CD56 FITC | BD Pharmingen | 340410 | Volume: 5 |
| Antibody: CD244 (2B4) PE | BD Pharmingen | 550816 | Volume: 5 |
| Antibody: CD3 PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555341 | Volume: 5 |
| Antibody: CD197 (CCR7) APC | eBiosciences | 17-1979-42 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 80 | |
References
- McKenna, D. H. Jr Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience. Transfusion. 47, 520-520 (2007).
- Koehl, U. ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children. Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).
- Klingemann, H. G., Martinson, J. ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications. Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).
- Ayello, J. Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering. Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).
- Carlens, S. A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells. Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).
- Boissel, L. Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells. Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).
- North, J. Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation. J Immunol. 178, 85-85 (2007).
- Berg, M. Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells. Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).
- Fujisaki, H. Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy. Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).
- Fujisaki, H. Replicative potential of human natural killer cells. Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).
- Gong, W. Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15. Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).
