Summary
Protocol
Подготовка Коллагеназа
- Отвешивать коллагеназы в 50 мл конические и добавить изоляции буфера, чтобы конечная концентрация, как указано в таблице ниже. Растворите коллагеназы на вортексе.
(12 мышей + 2 дополнительных мышей = 14 мышей х 5 мл / мышь = 70 мл полное решение коллагеназы)
(70 мл х 0,5 мг / мл или 0,3 мг / мл = 35 мг или 21 мг общего коллагеназы Р)Напряжение Возраст Коллагеназа Р (мг / мл) Время (мин) C3H, Balb / С, В6 > 12 недель 0,8 17 C3H, Balb / С, В6 <= 12 недель 0,5 13 NOD, NOR, ОТСУТСТВИЯ > 12 недель 0,8 17 NOD, NOR, ОТСУТСТВИЯ <= 12 недель 0,5 17 - Внесите 2 мл коллагеназы раствора в каждую ампулу стекла и место на льду. Нагрузка каждого 5-мл шприц 3 мл коллагеназы добавить иглой 30g и место в лед (подготовка в капот).
Растяжение
- Незадолго до вскрытия, жертву животного шейки дислокации. Спрей всего тела с 70% этанола, что делает его совершенно мокрый. Сделать V-insision, начиная с области половых органов. Поверните мышь так хвост отворачивается от вас.
- Удалить кишечника в левой части открытой мыши. Это выставит поджелудочной железы и общего желчного протока.
- Место кровоостанавливающего зажима на обе стороны тонкой кишки, где желчных протоков стоков, оставляя небольшой карман для коллагеназы решение войти в кишечнике.
- Inflate поджелудочной железы через желчный проток с иглой 30g и 5 мл шприц, содержащий 3 мл холодного раствора коллагеназы, начиная с желчным пузырем.
- Удаление поджелудочной железы из тела и поместить его в силиконизированный флакон с 2 мл коллагеназы решение. Этот шаг должен быть сделан быстро и чисто, как это возможно, сведения к минимуму сбор жира и соединительной ткани.
- Место флакон на льду и повторите шаг 3 со следующей мыши.
Пищеварение
- Печать каждого флакона и поместить его в 37 ° С водяной бане. Инкубируйте 13-17 минут (время варьируется в зависимости от штамма и возраста животного).
- После истечения времени, встряхнуть флакон энергично. Поджелудочной железы должны разваливаться.
- Залить каждую переварить через большую стерильной фильтр погрузиться в стерильную 1000 мл стакан и с силой пипетки с экрана промывочным раствором. Внесите дайджесты в 50 мл пробирки conicals (3 pancreata/50 мл трубки: при п = 12, достаточно использовать промывочный буфер, чтобы сделать окончательный объем 200 мл и отказаться от ее 4x50 мл пробирки). Разбавление должно быть сделано быстро и на льду, чтобы избежать нежелательных пищеварения островок.
- Спином вниз: Пуск центрифуги. Когда она достигает 1300 оборотов в минуту, выключить его.
- Аспирируйте супернатант, оставив ~ 5 мл. Будьте очень осторожны, чтобы не аспирата гранул.
- Ресуспендируют гранул, нажав энергично рукой, а затем добавить 50 мл промывочного буфера.
- Спином вниз: Пуск центрифуги. Когда она достигает 1300 оборотов в минуту, выключить его.
- Ресуспендируют шарик и промыть 5 мл промывочного буфера.
- Передача 5 мл до 15 мл конические и спином вниз, как указано выше.
- Аспирируйте супернатант как можно более полно. (Оставшееся буфера может привести к изменению плотности Ficoll.)
Ficoll
Выполнить быстро. Долгосрочные Ficoll экспозиции является токсичным для островков.
- Убедитесь, что гранулы полностью разбит перед добавлением Ficoll (непрерывную ткань трудно ресуспендируют в Ficoll).
- Ресуспендируют гранул в 7 мл Ficoll, плотность 1,108, по вортексе энергично.
- Слой друг на плотность Ficoll 2 мл каждого из оставшихся плотности в таком порядке: 1,096, 1,069, то 1,037.
- Спиновые в течение 15 минут при 1800 оборотов в минуту на 4 градуса, с перерывом OFF!
- Выберите островки из второй слой с помощью spoid (стерильный рlastic пипетки). Передача всех коллекций в 50 мл конические, содержащей ~ 25 мл холодного буфера.
- Вымойте, как и выше, в 3 раза промывочным буфером (повторив шаг 12-15).
- Ресуспендируют островков в 20 мл RPMI-1640 (содержащей 10% FCS и пенициллин и стрептомицин, HEPES, MEM-NEAA) и аккуратно перемешать. Удалить 100 мкл образца для подсчета голосов.
- Передача 100 мкл до 35 мм грид-пластину, содержащую 1 мл среды и 1 мл дитизоном.
- Инкубируйте оставшиеся островки в RPMI 1640 году, в 37 ° C, 7% СО 2 инкубатора, в 160 мм пластин с в общей сложности 30 мл среды / пластину.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dithizone | reagent | Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed. | ||
| PBS | Buffer | |||
| HBSS | Buffer | |||
| Isolation soln. | Buffer | HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4 | ||
| Wash soln. | Buffer | Isolation buffer containing 1mM CaCl2 | ||
| Collagenase P | Boehringer Ingeheim | 1213873 | ||
| Dissection tools | Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue) | |||
| Syringe | sterile, 5ml, 1/mouse. | |||
| 30 G needles | sterile, 1/syringe | |||
| siliconized glass vials w/Teflon cap | Fisher Scientific | 213-018-54 | sterile, 1/mouse | |
| large sink strainer | sterile | |||
| 1000 ml Beaker | sterile | |||
| Gauze pads | 4x4, 2/mouse | |||
| plastic eye dropper | sterile | |||
| Mice | Animal | |||
