Summary
इस अनुच्छेद में, हम सर्जरी प्रक्रिया का वर्णन किया और अति पतली polyimide आधारित एक माउस मॉडल में encephalography उच्च घनत्व (ईईजी) के अधिग्रहण के लिए माउस खोपड़ी पर microelectrode सरणी (PBM सरणी) के आरोपण के लिए युक्तियाँ से निपटने.
Abstract
Electroencephalogram (ईईजी) बड़े पैमाने पर एक स्तर पर neuronal आबादी की औसतन बिजली की गतिविधि का संकेत है. यह व्यापक रूप से संज्ञानात्मक तंत्रिका विज्ञान में एक noninvasive मस्तिष्क निगरानी उपकरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तंत्रिका विज्ञान में मिर्गी और सो विकारों के लिए एक नैदानिक उपकरण के रूप में उपयोग किया जाता है. हालांकि, ईईजी ताल पीढ़ी की अंतर्निहित तंत्र घूंघट के तहत अब भी है. हाल ही में शुरू की उच्च संकल्प 1 ईईजी माउस के लिए microelectrode polyimide आधारित (PBM सरणी) परीक्षणों के एक अमीर आनुवंशिक संसाधन है कि माउस मॉडल जटिल ईईजी पीढ़ी की प्रक्रिया के विश्लेषण के लिए शामिल पर आधारित ईईजी संकेतों पर neurophysiological सवालों के जवाब एक है. Nanofabricated PBM-सरणी के इस माउस खोपड़ी के लिए आवेदन बड़े पैमाने पर ट्रांसजेनिक चूहों के मस्तिष्क गतिविधि को इकट्ठा करने के लिए एक कुशल उपकरण है और व्यवहार के साथ संयोजन के रूप में कुछ ईईजी लय के लिए तंत्रिका संबद्ध की पहचान accommodates. हालांकि इसकी मोटाई अति पतली और बंटवारा संरचना से निपटने और PBM सरणी के आरोपण में एक परेशानी का कारण. प्रस्तुत वीडियो में, एक माउस खोपड़ी पर PBM सरणी के आरोपण के लिए तैयारी और शल्य चिकित्सा कदम कदम से कदम में वर्णित हैं. हैंडलिंग और शल्य आरोपण में मदद शोधकर्ताओं सफल भी प्रदान की जाती हैं.
Protocol
1. सारांश
C57BL/6J - 129S4/SvJae संकर चूहों (12 ~ 15 सप्ताह पुरानी) (120 आईपी मिलीग्राम / किग्रा) ketamine और xylazine (6 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) कॉकटेल के साथ anesthetized हैं. पैर की अंगुली या बन्द रखो टेल संज्ञाहरण की गहराई का निरीक्षण करने के लिए सर्जरी से पहले. माउस stereotaxic तंत्र (डेविड Kopf उपकरण, 902 मॉडल, खलीफा, संयुक्त राज्य अमरीका) से तय हो गई है. खोपड़ी के बारे में 25 मिमी दर्द कम करने के लिए lidocaine उपचार के तहत खोपड़ी बेनकाब midline पर छिन्न है. खोपड़ी पर किसी भी मलबे से खारा लथपथ कपास सुझावों द्वारा नष्ट इलेक्ट्रोड की खोपड़ी का पालन बढ़ाने के लिए. bregma और लैम्ब्डा अंक के रूप में चिह्नित कर रहे हैं और एक ही क्षैतिज प्लेन में सेट है. polyimide आधारित microelectrode सरणी (PBM सरणी) तो तैनात है कि अपनी ऊर्ध्वाधर midline खोपड़ी के midline से मिलता है. bregma बिंदु PBM सरणी के पूर्वकाल के 5 वें परत के बीच में स्थित होना चाहिए. दो या तीन microscrews दंत सीमेंट के साथ इलेक्ट्रोड की स्थिति को सुरक्षित करने में मदद करने के लिए खोपड़ी के किनारे में अशक्त स्थान पर उपयोग किया जाता है. PBM सरणी संबंधक propping के लिए, हम सिर के बीच एक अकड़ स्थिति, और यह दंत सीमेंट के साथ कवर. इलाज करने के बाद, छिन्न त्वचा sutured है, और कम से कम 5 दिन वसूली के लिए दिया जाता है. वसूली के दौरान चूहों को भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ अलग - अलग पिंजरों में रखे जाते हैं. वसूली के बाद, ईईजी रिकॉर्डिंग प्रदर्शन किया है. पशु देखभाल, शल्य चिकित्सा, और रिकॉर्डिंग प्रक्रियाओं अधिनियम 1992 की कोरिया लैब पशु देखभाल विनियम और जुड़े दिशा निर्देशों के बाद संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के लिए दिशा निर्देशों के साथ अनुसार में थे. इस पांडुलिपि में PBM सरणियों चोई द्वारा वर्णित के रूप में गढ़े गए थे. एट. अल 1 लेखकों संपर्क करने के लिए वीडियो में एक ही PBM-सरणी का उपयोग करें .
2. प्रक्रिया
- निष्फल शल्य चिकित्सा उपकरण और stereotaxic तंत्र तैयार करें.
- संज्ञाहरण (जैसे, / 120 और 60 की एक खुराक के साथ xylazine ketamine आईपी मिलीग्राम / किग्रा, repectively) के साथ माउस anesthetize. पैर की अंगुली या बन्द रखो टेल संज्ञाहरण की गहराई का निरीक्षण करने के लिए सर्जरी से पहले.
- Stereotaxic तंत्र पर माउस कान नहर में कान सलाखों रखने और यह जगह में कस करके माउस माउंट. आँखें biocompatible जेली (उदाहरण के लिए, पेट्रोलियम जेली) के साथ कवर किया जा सकता सर्जरी के प्रकाश से सुखाने से आँखों रखना. 70% इथेनॉल के साथ है माउस के सिर मॉइस्चराइजिंग के बाद, उसके सिर बंद फर दाढ़ी.
- एक खोपड़ी के साथ 25 मिमी के बारे में सिर काटकर अलग कर देना. यह 2% की एक छोटी राशि लागू करने के लिए recommendable है खोपड़ी के तहत हाइड्रोक्लोराइड lidocaine. माइक्रो clamps के साथ त्वचा (ललित विज्ञान उपकरण (यूएसए), Inc, 18052-03, खलीफा, संयुक्त राज्य अमरीका) पिंच चीरा खुला रखने के लिए.
- खोपड़ी पर खारा से लथपथ कपास swabs खोपड़ी PBM सरणी के पालन बढ़ाने के साथ किसी भी शेष ऊतक मलबे को साफ कर लें. झिल्ली के अवशेषों को हटाने के लिए पेरोक्साइड का प्रयोग भी प्रभावी है.
- Bregma और लैम्ब्डा अंक पर खोपड़ी का पता लगाएं, और उन्हें तेल आधारित एक मार्कर पेन से निशान. PBM सरणी इतनी जगह है कि अपने ऊर्ध्वाधर midline जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है खोपड़ी के midline से मिलता है. PBM सरणी के पूर्वकाल के नल का पानी की एक बूंद के साथ 5 वें परत के बीच में bregma स्थिति . झाड़ू से साफ़ करना औसत दर्जे का पार्श्व बेहतर पालन करने के लिए ध्यान से फिल्म इलेक्ट्रोड. फिल्म इलेक्ट्रोड छड़ी खोपड़ी को सख्त आदेश में मदद करने के लिए, फिल्म इलेक्ट्रोड खोपड़ी पर पूरी तरह से शुष्क होना चाहिए. फिल्म इलेक्ट्रोड खोपड़ी पर वान डर वाल्स बल द्वारा तय किया जाना बना रहता है. जब इलेक्ट्रोड फिर से स्थिति, नल का पानी की एक बूंद फाड़ा जा रहा से इलेक्ट्रोड को रोकने के लिए आवश्यक है.
चित्रा 1 (बाएं) एक माउस खोपड़ी पर PBM-सरणी. anterio - पीछे PBM सरणी की धुरी bregma (बीपी) और लैम्ब्डा अंक (एल.पी.) के बीच की रेखा से मेल खाता है. (राइट) माउस मस्तिष्क की सतह पर ख्यात इलेक्ट्रोड पदों. माउस का शरीर रचना विज्ञान 3 - डी एक वयस्क C57BL/6J माउस Brookhaven राष्ट्रीय प्रयोगशाला और इलेक्ट्रोड स्थानों में उत्पादित मस्तिष्क का एमआरआई डिजिटल एटलस डेटाबेस से खंडों हैं stereotaxic माप के अनुसार चिह्नित है. ग्राउंड (जी) और संदर्भ (रेफरी) इलेक्ट्रोड सही आंकड़ा में चिह्नित कर रहे हैं. - खोपड़ी के खुले क्षेत्र पर कम से कम तीन पदों को चिह्नित करें, और तब उन समर्थन microscrews की स्थिति के लिए एक दंत ड्रिल का उपयोग कर स्थानों में छेद कर. इन microscrews डंडा एक भूमिका है और यंत्रवत् खोपड़ी पर दंत सीमेंट का समर्थन. ड्रिलिंग के दौरान अतिरिक्त सावधानी की जरूरत है. चूंकि माउस खोपड़ी पतली परत के होते हैं, नकसीर आसानी से ड्रिलिंग के दौरान हो सकता है. जब खून बह रहा होता है, ड्रिलिंग बंद करो और छेद में hemostatic पाउडर की एक छोटी राशि लागू.
- दंत एक्रिलिक सीमेंट (उपगम्यता - दंत चिकित्सा, स्व - इलाज उपगम्यता, नीदरलैंड) लागू PBM सरणी, लंगर शिकंजा, और खोपड़ी के बाकी को कवर करने के लिए. एक चिपचिपा चिपचिपा और ग में दंत सीमेंट तैयारondition.
- मजबूत गोंद (उदाहरण के लिए, लॉकटाइट, हेंकेल लॉकटाइट कॉर्प, डबलिन, आयरलैंड) का उपयोग कर सिर के मध्य पर अकड़ के रूप में एक कठोर छड़ी स्थिति. डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप संबंधक विमान की पीठ पर रखो. PBM सरणी संबंधक अकड़ के टिप के साथ कनेक्ट करने की स्थिति में हेरफेर. खोपड़ी और संबंधक के बीच अनुलंब दूरी 5 मिमी से अधिक होना चाहिए. संबंधक विमान और बेहतर आसंजन के लिए मजबूत गोंद का उपयोग छड़ी की नोक रहो.
- यकीन है कि दंत सीमेंट पूरी तरह से ठीक है. फिर खोपड़ी पर दंत एक्रिलिक सीमेंट और संबंधक विमान की पीठ खोपड़ी के लिए संबंधक सुरक्षित लागू होते हैं.
- सूक्ष्म clamps निकालें. सीवन निष्फल सिलाई फाइबर के साथ त्वचा छिन्न. तंत्र से माउस निकालें. आप अतिरिक्त दंत एक्रिलिक सीमेंट लागू करने के लिए उजागर खोपड़ी को ढाल सकता है. सीमेंट और sutured त्वचा के चारों ओर एक एंटीबायोटिक (fucidin मरहम, दांग फार्मेसी Wha, दक्षिण कोरिया) को लागू करें.
- एक निष्फल पिंजरे में माउस प्लेस जब तक यह अपने मूल शरीर के वजन (लगभग 5 से 7 दिनों) ठीक है. यह किसी भी पिंजरे साथी परिचय नहीं की सिफारिश की है.
- वसूली के बाद, एक हल्के वजन मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी) के एक multichannel अपने स्वयं के पिंजरे में ईईजी एम्पलीफायर प्रणाली (2 Synamps, उत्तरी केरोलिना, संयुक्त राज्य अमेरिका) के headbox संबंधक द्वारा माउस कनेक्ट . जोड़ने लाइनों को ध्यान से इलाज किया जाना चाहिए तो यह उलझ नहीं मिलता है.
- Habituation के 1 घंटे के बाद, ईईजी रिकॉर्डिंग करते हैं. 4.4 स्कैन. (उत्तरी केरोलिना, संयुक्त राज्य अमरीका) अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था. ईईजी माउस के एक विशिष्ट समय का पता लगाने सेट चित्रा 2 में दिखाया गया है. यह माउस के व्यवहार से संबंधित करने के लिए वीडियो करने के लिए लॉग इन करने के लिए सिफारिश की है.
- स्थलाकृतिक मस्तिष्क नक्शा उत्पादन प्राप्त संकेत MATLAB (Mathworks, Natick, MA, संयुक्त राज्य अमेरिका) के द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. माउस मस्तिष्क के ईईजी शक्ति नक्शे का नमूना topographies चित्रा 3 में दिखाया जाता है.
3. प्रतिनिधि परिणाम
यदि ऊपर शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं को सही ढंग से आयोजित की जाती हैं, 40 चैनलों माउस ईईजी रिकॉर्डिंग सफलतापूर्वक बुरा चैनलों के बिना प्रदर्शन किया जाएगा. बाद के आंकड़े प्रतिनिधि कच्चे ईईजी निशान और स्थलाकृतिक नक्शे दिखा.
चित्रा 2. ईईजी अनुभव अभाव इंजेक्शन γ-butyrolactone (GBL, 50mg/kg, आईपी) से प्रेरित जब्ती का एक नमूना का पता लगाने. लाल पट्टी अभाव जब्ती के दौरान कील की लहर और निर्वहन (SWDs) इंगित करता है. क्षैतिज और अनुलंब अक्षों समय और वोल्टेज क्रमशः संकेत मिलता है. संख्या इस प्रकार चैनल असेंबल चित्रा में परिभाषित है. 1 (दाएं).
चित्रा 3. स्थलाकृतिक नक्शे 06/02 हर्ट्ज बिजली वितरण संकेत मिलता है. colorbar में मान शक्ति नक्शे के रंग पैमाने का प्रतिनिधित्व करता है. कील की लहर और निर्वहन (SWDs) (GBL, 50mg/kg, आईपी) γ-butyrolactone, बड़े frontoparietal cortical क्षेत्रों में शक्ति से काफी प्रेरित के दौरान GBL इंजेक्शन (बेसलाइन) से पहले सत्ता के साथ तुलना में वृद्धि.
Discussion
यहाँ हम शल्य चिकित्सा और रिकॉर्डिंग करने के लिए स्वतंत्र रूप से चूहों बढ़ने में उच्च घनत्व ईईजी अधिग्रहण प्रक्रियाओं की रिपोर्ट. इस विधि हमें माउस मॉडल से प्राप्त करने के लिए कार्यात्मक ब्रेन नक्शे सहज लयबद्ध 1,2 या घटना से संबंधित मस्तिष्क गतिविधियों के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है.
PBM-सरणी में सभी चैनलों के अधिग्रहण के लिए एक आवश्यक पूरे ब्रेन मैपिंग प्राप्त शर्त है, लेकिन हर चैनल के लिए एक सुरक्षित संपर्क बनाने बहुत चुनौतीपूर्ण है. खोपड़ी के लिए चैनल के लगातार संपर्क बनाए रखने के लिए, निम्न कार्यविधियों के लिए महत्वपूर्ण हो पाए जाते हैं. सबसे पहले, खोपड़ी से खोपड़ी पर किसी भी ऊतक मलबे के अलावा इलेक्ट्रोड निर्धारित कर सकते हैं. इसलिए यह बहुत महत्वपूर्ण है निष्फल कपास swabs के साथ सभी ऊतक मलबे को हटाने और खोपड़ी की सतह शुष्क. दूसरे, PBM सरणी की क्षमता है जो खोपड़ी की सतह के लिए छड़ी कर सकते हैं वान डर वाल्स बल है. यह एक खोपड़ी PBM सरणी लागू पानी की परत बनाने के लिए खोपड़ी पर नल का पानी की एक बूंद से पहले लागू करने का सुझाव दिया है. तीसरा, दंत सीमेंट का सही चिपचिपापन बहुत महत्वपूर्ण है. यदि यह भी बहती है, यह PBM-सरणी के तहत एक इन्सुलेट परत का निर्माण कर सकते हैं. यदि यह बहुत घना है, दंत सीमेंट आसानी से अपने स्वयं के वजन की वजह से खोपड़ी से अलग गिर जाएगी. अंत में, कम से कम तीन समर्थन microscrews दंत कसकर खोपड़ी करने के लिए बाध्य सीमेंट बनाने के लिए खोपड़ी पर प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए. समर्थन microscrews दंत सीमेंट पकड़ और सुरक्षित headstage है, जो लंबी अवधि के अध्ययन के लिए आवश्यक है.
PBM-सरणी के आवेदन वयस्क इसके आकार और वजन की वजह से चूहों के साथ पुरानी अध्ययन करने के लिए सीमित हो जाएगा. हमारे अनुभव के आधार पर, 25 ग्राम की तुलना में भारी चूहों उपयोग करने के लिए पर्याप्त हैं. आगे अनुप्रयोगों के रूप में, हमारे PBM सरणी में शाखाओं के बीच अशक्त अंतरिक्ष के माध्यम से, एक रिकॉर्डिंग या उत्तेजना उद्देश्य के लिए माध्यमिक इलेक्ट्रोड परिचय हो सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
केआईएसटी अनुदान (2E21510), शिक्षा मंत्रालय के राष्ट्रीय साहब वैज्ञानिक कार्यक्रम, और कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन के माध्यम से मूल प्रौद्योगिकी मस्तिष्क विज्ञान के लिए अनुसंधान कार्यक्रम के शिक्षा मंत्रालय, विज्ञान और प्रौद्योगिकी (2,010-0,018,944) द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γbutyrolactone | Sigma-Aldrich | H7629-500G |
References
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
- Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).
