Summary
In diesem Artikel beschrieben wir die Chirurgie Verfahren und Handhabung Tipps für die Implantation von ultra-dünnen Polyimid-Basis Mikroelektroden-Array (PBM-array) auf der Maus Schädel für den Erwerb von High-Density-Encephalographie (EEG) in einem Mausmodell.
Abstract
Elektroenzephalogramm (EEG) zeigt die gemittelten elektrischen Aktivität des neuronalen Populationen auf eine groß angelegte Ebene. Es wird allgemein als eine nicht-invasive Gehirn-Monitoring-Tool in den kognitiven Neurowissenschaften sowie ein Diagnose-Tool für Epilepsie und Schlafstörungen in der Neurologie eingesetzt. Allerdings ist die zugrunde liegende Mechanismus des EEG Rhythmus Generation noch unter dem Schleier. Kürzlich eingeführte Polyimid-Basis Mikroelektrode (PBM-array) für hochauflösende Maus EEG 1 ist einer der Studien zu den neurophysiologischen Fragen zur EEG-Signale auf eine reiche genetische Ressource, die das Maus-Modell enthält für die Analyse von komplexen EEG-Generation-Prozess basiert beantworten. Diese Anwendung der nanofabricated PBM-Array Maus Schädel ist ein effizientes Werkzeug für das Sammeln großer Hirnaktivität von transgenen Mäusen und beherbergt um die neuronalen Korrelate bestimmter EEG-Rhythmen in Verbindung mit Verhalten zu identifizieren. Doch seine ultra-dünne Dicke und gegabelte Struktur zu Problemen führen in der Handhabung und Implantation von PBM-Array. In der vorgestellten Videos sind die Vorbereitung und Operation Schritte für die Implantation von PBM-Array auf einem Maus Schädel Schritt für Schritt beschrieben. Handhabung und Chirurgie Tipps helfen Forschern gelingt Implantation sind ebenfalls vorhanden.
Protocol
1. Zusammenfassung
C57BL/6J - 129S4/SvJae Hybrid-Mäusen (12 ~ 15 Wochen alt) werden mit Ketamin (120 mg / kg ip) und Xylazin (6 mg / kg, ip) Cocktail. Schwanz oder Zehen kneifen geht der Operation, um die Tiefe der Narkose zu untersuchen. Die Maus wird durch stereotaktische Apparat (David Kopf Instruments, Modell 902, Calif, USA) fixiert. Die Kopfhaut wird auf der Mittellinie etwa 25 mm auf den Schädel unter dem Lidocain-Behandlung zur Schmerzreduktion aussetzen eingeschnitten. Alle Ablagerungen auf den Schädel wird durch Kochsalzlösung getränkt Baumwolle Tipps abgetrocknet, um die Einhaltung der Elektrode auf den Schädel zu verbessern. Die Bregma und Lambda-Punkte markiert sind und stellen in der gleichen horizontalen Ebene. Die Polyimid-Basis Mikroelektroden-Array (PBM-array), so dass die vertikale Mittellinie der Mittellinie des Schädels entspricht positioniert. Die Bregma Punkt sollte in der Mitte des 5. Schicht der vorderen von PBM-Arrays angeordnet werden. Zwei oder drei Mikroschrauben sind an der Nullraum in den Rand des Schädels zur Sicherung der Position der Elektrode mit Zahnzement verwendet. Für stützen die PBM-Array-Anschluss, positionieren wir eine Strebe in der Mitte des Kopfes, und decken Sie es mit Zahnzement. Nach dem Aushärten wird der eingeschnittenen Haut vernäht, und mindestens 5 Tage sind für die Verwertung gegeben. Während der Wiederherstellung werden die Mäuse in einzelnen Käfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht. Nach der Wiederherstellung sind EEG-Aufzeichnung durchgeführt. Tierpflege, chirurgischen und Aufzeichnung Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss, folgende Act 1992 der Korea Lab Animal Care Regulations und die damit verbundenen Richtlinien. Die PBM-Arrays in diesem Manuskript wurden hergestellt, wie Choi beschrieben. et. al. 1 Bitte kontaktieren Sie die Autoren auf die gleiche PBM-Array in dem Video zu verwenden.
2. Verfahren
- Bereiten Sie das sterilisierte chirurgische Instrumente und stereotaktischen Apparat.
- Anesthetize der Maus mit der Anästhesie (zB Ketamin / Xylazin mit einer Dosis von 120 mg und 60 mg / kg ip, repectively). Schwanz oder Zehen kneifen geht der Operation, um die Tiefe der Narkose zu untersuchen.
- Montieren Sie die Maus auf den stereotaktischen Apparat, indem Ohr Bars in der Maus Gehörgang und ziehen Sie es in Stelle. Die Augen können mit biokompatiblen Gelee (zB Vaseline) abgedeckt werden, um die Augen vor dem Austrocknen durch die Operation leicht zu halten. Nach Befeuchtung der Maus den Kopf mit 70% Ethanol, rasieren das Fell ihm den Kopf ab.
- Incise den Kopf ca. 25 mm mit einer Kopfhaut. Es empfiehlt sich, eine kleine Menge von 2% gilt Lidocainhydrochlorid unter der Kopfhaut. Drücken Sie die Haut mit Mikro-Klemmen (Fine Science Tools (USA), Inc., 18052-03, Calif, USA) zu halten Einschnitt weit offen.
- Wischen Sie verbleibende Gewebereste auf dem Schädel mit Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen verbessern die Einhaltung der PBM-Array an den Schädel. Mit Wasserstoffperoxid zur Beseitigung des Rückstands der Membran ist ebenfalls wirksam.
- Finden Sie die Bregma und Lambda-Punkte auf dem Schädel, und markieren Sie diese mit einem Öl-basierte Marker. Legen Sie die PBM-Array, so dass die vertikale Mittellinie trifft der Mittellinie des Schädels, wie in Abbildung 1 dargestellt. Positionieren Sie den Bregma in der Mitte des 5. Schicht der vorderen von PBM-Array mit einem Tropfen Leitungswasser. Swab der Film Elektrode aus der medial nach lateral sorgfältig für eine bessere Einhaltung. Um den Film Elektrode haften fester an den Schädel zu helfen, sollte der Film Elektrode vollständig trocken auf dem Schädel. Der Film Elektrode bleibt auf dem Schädel durch van der Waals-Kraft fixieren. Wenn Neupositionierung der Elektrode, ist ein weiterer Tropfen Leitungswasser notwendig, um die Elektrode entfernt, zerrissen zu verhindern.
Abbildung 1 (links). Ein PBM-Array auf der Maus Schädel. Die anterio-posterioren Achse des PBM-Array entspricht der Linie zwischen Bregma (BP) und Lambda-Punkte (LP). (Rechts) Die vermeintliche Elektrodenpositionen auf der Maus Hirnoberfläche. Die Anatomie der Maus segmentiert aus dem 3-D-MRT digitalen Atlas Datenbank von einem Erwachsenen C57BL/6J Gehirn der Maus in Brookhaven National Lab und die Elektrode Standorten produziert werden nach der stereotaktischen Messung markiert. Ground (G) und Referenz (Ref) Elektroden sind in der Abbildung rechts markiert. - Mark mindestens drei Positionen auf dem offenen Bereich des Schädels, und dann Löcher in den Orten mit einer zahnärztlichen Bohrer für die Positionierung der Unterstützung Mikroschrauben. Diese Mikroschrauben eine Rolle von Runge und mechanisch unterstützen die Zahnzement auf den Schädel. Besondere Vorsicht ist beim Bohren notwendig. Da die Maus Schädel besteht aus dünnen Schichten, können Blutungen auftreten, einfach während des Bohrens. Wenn die Blutung auftritt, halten Sie Bohr-und gelten kleine Menge blutstillende Pulver in das Loch.
- Übernehmen Sie die zahnärztliche Acrylzement (Vertex-Dental, Vertex Self-Härtung, Niederlande), die PBM-Array, Ankerschrauben, und der Rest des Schädels zu decken. Bereiten Sie den Zahnzement in einer klebrigen und zähen condition.
- Position eine starre Stick als einer Strebe auf der Mitte des Kopfes mit starken Klebstoff (z. B. Loctite, Henkel Loctite Corp, Dublin, Irland). Legen Sie doppelseitigen Klebeband auf der Rückseite des Steckers Ebene. Bearbeiten Sie die PBM-Array-Anschluss der Lage, mit der Spitze des Stabes verbinden. Der vertikale Abstand zwischen dem Schädel und dem Anschluss sollte mehr als 5 mm. Stecken Sie die Stecker-Ebene und der Spitze des Stockes mit starken Klebstoff für eine bessere Haftung.
- Stellen Sie sicher, dass die Zahnzement vollständig geheilt ist. Dann gelten die zahnärztliche Acrylzement über den Schädel und die Rückseite des Steckers Flugzeug mit dem Anschluss an den Schädel zu sichern.
- Entfernen Sie die Micro-Klemmen. Suture eingeschnittenen Haut mit sterilisierten Nähte Faser. Entfernen Sie die Maus aus dem Gerät. Sie können daher keine zusätzliche zahnärztliche Acrylzement der exponierten Schädel Schild. Wenden Sie ein Antibiotikum (Fucidin Salbe, Dong Wha Apotheke, Süd-Korea) um den Zement-und vernäht Haut.
- Platzieren Sie die Maus in eine sterilisierte Käfig, bis es seine ursprüngliche Körpergewicht (ca. 5 bis 7 Tage) erholt. Es wird empfohlen, keine Käfig Kollegen vorzustellen.
- Nach der Erholung, verbinden Sie die Maus von einem leichten Leiterplatte (PCB) Anschluss mit dem Stoffauflauf einer Mehrkanal-EEG-Verstärker-System (Synamps 2, North Carolina, USA) in seinen eigenen Käfig. Die Verbindungsleitungen sollten sorgfältig behandelt werden, damit es nicht verheddert nicht zu bekommen.
- Nach 1 Stunde Gewöhnung führen EEG-Aufzeichnung. Scan 4.4. (North Carolina, USA) Übernahme-Software wurde in diesem Experiment verwendet. Ein typischer Trace Reihe von Maus-EEG ist in Abbildung 2 dargestellt. Es wird empfohlen, um das Video log, um das Verhalten der Maus beziehen.
- Erhaltene Signal kann durch MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) analysiert werden, um die topographische Karte des Gehirns zu erzeugen. Beispiel Topographien von EEG-Strom Karte Maushirn sind in Abbildung 3 dargestellt.
3. Repräsentative Ergebnisse
Wenn über chirurgische Verfahren korrekt durchgeführt werden, werden mit 40 Kanälen Maus EEG-Aufzeichnung erfolgreich und ohne schlechtes Kanälen durchgeführt werden. Folgenden Abbildungen zeigen die repräsentativen Roh-EEG-Spuren und topografische Karten.
Abbildung 2. Eine Probe Spuren von EEG erleben Absence durch Injektion γ-Butyrolacton (GBL, 50mg/kg, ip) induziert. Red Balken zeigt Spike-wave-und Entladungen (SWDs) während der Abwesenheit Beschlagnahme. Die horizontalen und vertikalen Achsen geben Zeit und Spannung, bzw.. Die Nummer folgt dem Kanal Montage in Abbildung definiert. 1 (rechts).
Abbildung 3. Die topographischen Karten zeigen von 2-6 Hz der Energieverteilung. Der Wert in der colorbar stellt die Farbskala der Macht Karte. Während Spike-wave-und Entladungen (SWDs) von γ-Butyrolacton (GBL, 50mg/kg, ip), die Macht in den großen frontoparietal kortikalen Regionen induzierte signifikant verglichen mit der Macht, bevor GBL-Injektion (Baseline) zu erhöhen.
Discussion
Hier berichten wir über chirurgische und Aufzeichnung Verfahren zur High-Density-EEG in sich frei bewegenden Mäusen zu erwerben. Diese Methode ermöglicht es uns, funktionale Gehirn Karten von Maus-Modell zu erhalten, um molekulare Mechanismen der spontanen rhythmischen 1,2 oder ein Ereignis im Zusammenhang Hirnaktivitäten zu studieren.
Übernahme aller Kanäle in der PBM-Array ist eine notwendige Voraussetzung, um ganze Brain Mapping zu erhalten, macht jedoch eine sichere Kontaktierung für jeden Kanal ist eine große Herausforderung. Zur Aufrechterhaltung gleichmäßigen Kontakt des Kanals auf dem Schädel, sind die folgenden Verfahren erwies sich als wichtig. Zunächst einmal kann jeder Gewebereste auf dem Schädel auseinander gesetzt die Elektrode aus dem Schädel. Daher ist es sehr wichtig, alle Gewebereste mit sterilisierten Wattestäbchen entfernen und trocken bis der Kopfoberfläche. Zweitens ist die Fähigkeit des PBM-Array, das auf der Kopfoberfläche Stick kann van der Waals-Kraft. Es wird vorgeschlagen, einen Tropfen Leitungswasser auf den Schädel zu Wasser Schicht bauen, bevor man gelten PBM-Array, um den Schädel gelten. Drittens ist die richtige Viskosität von Zahnzement sehr wichtig. Wenn es zu flüssig ist, kann es eine isolierende Schicht unter der PBM-Array zu bauen. Wenn es zu dicht ist, wird das Zahnzement leicht auseinander fallen aus dem Schädel durch sein eigenes Gewicht. Schließlich sollte mindestens drei tragenden Mikroschrauben auf dem Schädel der Zahnzement fest mit dem Schädel verbunden machen implantiert werden. Die Unterstützung Mikroschrauben halten die Zahnzement und sichern Sie die headstage, was wesentlich ist für die langfristige Studie.
Die Anwendung des PBM-Array wird zu einer chronischen Studie mit erwachsenen Mäusen aufgrund seiner Größe und Gewicht begrenzt. Basierend auf unserer Erfahrung, sind Mäuse mehr als 25 g ausreichend zu bedienen. Als weitere Anwendungen, durch die Null-Raum zwischen Filialen in unserer PBM-Array kann man einführen sekundären Elektroden für die Aufzeichnung oder Stimulation Zweck.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Unterstützt von KIST Grant (2E21510), National Honor Scientist Programm des Ministeriums für Bildung, und die Original Technology Research Program für Neurowissenschaften durch die National Research Foundation of Korea durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (2010-0018944) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γbutyrolactone | Sigma-Aldrich | H7629-500G |
References
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
- Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).
