Summary
Dans cet article, nous avons décrit la procédure de chirurgie et de la manutention des conseils pour l'implantation de l'ultra-mince matrice de microélectrodes à base de polyimide (PBM-array) sur le crâne de la souris pour l'acquisition de haute densité encéphalographie (EEG) dans un modèle murin.
Abstract
L'électroencéphalogramme (EEG) indique l'activité moyenne d'électricité des populations neuronales à un niveau de grande envergure. Il est largement utilisé comme un outil de surveillance non invasive du cerveau en neurosciences cognitives ainsi que d'un outil de diagnostic des troubles du sommeil et de l'épilepsie en neurologie. Cependant, le mécanisme sous-jacent de la génération du rythme EEG est encore sous le voile. Récemment introduite à base de polyimide microélectrode (PBM-array) pour la souris haute résolution EEG 1 est l'un des procès de répondre aux questions sur les signaux EEG neurophysiologique basé sur une riche ressource génétique qui contient le modèle de souris pour l'analyse des processus de génération de complexes EEG. Cette application de PBM-array nanofabricated au crâne de la souris est un outil efficace pour la collecte de l'activité cérébrale à grande échelle de souris transgéniques et accueille à identifier les corrélats neuraux de certains rythmes EEG en conjonction avec le comportement. Cependant, son ultra-mince épaisseur et la structure bifurqué provoquer une difficulté à la manipulation et l'implantation de PBM-tableau. Dans la vidéo présentée, les étapes de préparation et de la chirurgie pour l'implantation de PBM-array sur un crâne de souris sont décrites étape par étape. Conseils pour la manipulation et la chirurgie pour aider les chercheurs réussissent à l'implantation sont également fournis.
Protocol
1. Résumé
C57BL/6J - souris 129S4/SvJae hybrides (12 ~ 15 semaines) sont anesthésiés à la kétamine (120 mg / kg ip) et de xylazine (6 mg / kg, ip) de cocktail. Pincer la queue ou de l'orteil précède la chirurgie pour inspecter la profondeur de l'anesthésie. La souris est fixé par un appareil de stéréotaxie (David Kopf Instruments, modèle 902, Calif, USA). Le cuir chevelu est incisé sur la ligne médiane d'environ 25 mm pour exposer le crâne sous le traitement de lidocaïne pour réduire la douleur. Tous les débris sur le crâne est rayé par les conseils de coton imbibé de sérum physiologique pour améliorer l'adhérence de l'électrode sur le crâne. Les points bregma et lambda sont marqués et mis dans le même plan horizontal. Le tableau de polyimide microélectrode base (PBM-array) est placé de sorte que sa ligne médiane verticale rencontre la ligne médiane du crâne. Le point bregma doit être situé au milieu de la couche 5 ème de la partie antérieure de la PBM-tableau. Deux ou trois microscrews sont utilisés à l'espace nul dans le bord du crâne pour aider à sécuriser la position de l'électrode avec du ciment dentaire. Pour étayer le connecteur PBM-array, nous positionnons une jambe sur le milieu de la tête, et le couvrir avec du ciment dentaire. Après durcissement, la peau est suturée incisées, et au moins 5 jours sont donnés pour la récupération. Pendant la récupération, les souris sont logés dans des cages individuelles avec un accès libre à la nourriture et l'eau. Après la récupération, l'enregistrement EEG est effectué. Procédures de soins des animaux, de chirurgie et d'enregistrement ont été en conformité avec les directives pour la protection des animaux et du Comité institutionnel en oeuvre, suivant la loi de 1992 du Règlement de la Corée du Laboratoire de protection des animaux et des lignes directrices connexes. Les tableaux PBM-dans ce manuscrit ont été fabriqués comme décrit par Choi. et al. al. 1 S'il vous plaît contacter les auteurs à utiliser les mêmes PBM-array dans la vidéo.
2. Procédure
- Préparer les instruments chirurgicaux et stérilisés appareil stéréotaxique.
- Anesthésier la souris avec l'anesthésie (par exemple, la kétamine / xylazine avec une dose de 120 mg et 60 mg / kg ip, repectively). Pincer la queue ou de l'orteil précède la chirurgie pour inspecter la profondeur de l'anesthésie.
- Montez la souris sur l'appareil de stéréotaxie en plaçant les barres d'oreille dans le canal auditif de la souris et en le serrant à la place. Les yeux peuvent être recouverts de gelée biocompatible (par exemple, la gelée de pétrole) pour garder les yeux de sécher par la lumière chirurgie. Après hydratant la tête de la souris avec de l'éthanol à 70%, se raser la fourrure de sa tête.
- Inciser la tête d'environ 25 mm avec un cuir chevelu. Il est recommandé d'appliquer une petite quantité de chlorhydrate de lidocaïne 2% sous le cuir chevelu. Pincer la peau avec des pinces micro (Outils Fine Science (USA), Inc, 18052-03, Calif, USA) pour garder l'incision ouverte.
- Essuyez tous les débris de tissu restant sur le crâne avec des cotons-tiges imbibé de sérum physiologique renforcer l'adhésion de la PBM-array au crâne. L'utilisation du peroxyde pour enlever le résidu de la membrane est également efficace.
- Trouver le bregma et les points lambda sur le crâne, et les marquer avec un marqueur à base d'huile. Placez le PBM-array de telle sorte que sa ligne médiane verticale rencontre la ligne médiane du crâne comme le montre la figure 1. Position du bregma au milieu de la couche 5 e de la partie antérieure de la PBM-tableau avec une goutte d'eau du robinet. Swab l'électrode film du dedans en dehors soigneusement pour une meilleure adhérence. Afin d'aider le resserrement bâton de film d'électrode sur le crâne, l'électrode de film doit être complètement sec sur le crâne. L'électrode de film reste à être fixé sur le crâne par la force de van der Waals. Lorsque re-positionnement de l'électrode, une autre goutte d'eau du robinet est nécessaire pour empêcher l'électrode d'être déchiré.
Figure 1. (Gauche) Un PBM-array sur le crâne de la souris. L'axe antéro-postérieure de PBM-tableau correspond à la ligne entre bregma (BP) et les points lambda (LP). (À droite) La position des électrodes putatif sur la surface du cerveau de souris. L'anatomie de la souris sont segmentés de la 3-D IRM base de données atlas numérique d'un cerveau de souris C57BL/6J adulte produites au Brookhaven National Lab et les emplacements des électrodes sont marqués conformément à la mesure de stéréotaxie. Sol (G) et de référence (Ref) électrodes sont marqués dans la figure de droite. - Marquer au moins trois positions sur la zone ouverte du crâne, puis faire des trous dans ces endroits en utilisant une fraise de dentiste pour le positionnement de la microscrews appui. Ces microscrews ont un rôle de chandelier et mécaniquement soutenir le ciment dentaire sur le crâne. Précautions supplémentaires sont nécessaires pendant le forage. Depuis le crâne de la souris se compose de couches minces, l'hémorragie peut se produire facilement pendant le forage. Lorsque le saignement se produit, arrêter le forage et d'appliquer petite quantité de poudre hémostatique dans le trou.
- Appliquer le ciment acrylique dentaire (Vertex-Dental, Vertex auto-durcissement, les Pays-Bas) pour couvrir le PBM-tableau, vis d'ancrage, et le reste du crâne. Préparer le ciment dentaire dans un c gluantes et visqueusesondition.
- Position d'un bâton rigide comme une jambe de force sur le milieu de la tête avec de la colle forte (par exemple, Loctite, Henkel Loctite Corp, Dublin, Irlande). Mettez du ruban adhésif double-face sur le dos de l'avion connecteur. Modifiez la position du connecteur PBM-array de se connecter avec la pointe du mât. La distance verticale entre le crâne et le connecteur doit être supérieur à 5 mm. Bâton de l'avion connecteur et le bout du bâton à l'aide de la colle forte pour une meilleure adhérence.
- Assurez-vous que le ciment dentaire est complètement guérie. Ensuite, appliquez le ciment dentaire acrylique sur le crâne et la face arrière de l'avion connecteur pour fixer le connecteur sur le crâne.
- Retirer les pinces micro. Suture incisé la peau avec des fibres coutures stérilisé. Retirez la souris de l'appareil. Vous pouvez demander supplémentaires ciment acrylique dentaires pour protéger le crâne exposé. Appliquez un antibiotique (onguent Fucidin, Dong Wha pharmacie, la Corée du Sud) autour de la cimenterie et la peau suturée.
- Placez la souris dans une cage jusqu'à ce qu'il récupère stérilisés son poids corporel initial (environ 5 à 7 jours). Il est recommandé de ne pas introduire de compagnons de cage.
- Après la récupération, connectez la souris par un léger circuit imprimé (PCB) connecteur à la caisse de tête d'un système amplificateur EEG multicanal (Synamps 2, Caroline du Nord, USA) dans sa propre cage. Les lignes de raccordement doit être traité avec soin afin de ne pas s'emmêler.
- Après 1 heure d'accoutumance, effectuer un enregistrement EEG. Balayage 4.4. (Caroline du Nord, USA) a été utilisé un logiciel d'acquisition de cette expérience. Un jeu de temps typique des traces de la souris EEG est montré dans la figure 2. Il est recommandé de connecter la vidéo pour relier le comportement de la souris.
- Signal obtenu peut être analysé par MATLAB (The MathWorks, Natick, MA, USA) pour produire la carte topographique du cerveau. Topographies échantillon de carte puissance de l'EEG de cerveau de souris sont indiquées dans la figure 3.
3. Les résultats représentatifs
Si au-dessus de procédures chirurgicales sont correctement réalisées, l'enregistrement de la souris 40 canaux EEG sera réalisée avec succès, sans canaux mauvais. Chiffres suivants montrent le représentant premières traces de l'EEG et des cartes topographiques.
Figure 2. Une trace de l'échantillon de la saisie l'absence d'EEG induites par injection connaît γ-butyrolactone (GBL, 50mg/kg, ip). Barre rouge indique pointes-ondes et les rejets (SDDS) pendant la saisie d'absence. Les axes horizontaux et verticaux indiquent le temps et la tension, respectivement. Le nombre qui suit le montage de canaux définis dans la figure. 1 (à droite).
Figure 3. Les cartes topographiques montrent la distribution 2-6 Hz. La valeur de la barre de couleurs représente l'échelle de couleur de la carte de puissance. Pendant pointes-ondes et les rejets (SDDS) induit par γ-butyrolactone (GBL, 50mg/kg, ip), la puissance dans les régions corticales frontopariétale grandes augmenter de manière significative par rapport à l'alimentation avant l'injection de GBL (Baseline).
Discussion
Nous rapportons ici les procédures chirurgicales et l'enregistrement d'acquérir de haute densité EEG en se déplaçant librement souris. Cette méthode nous permet d'obtenir des cartes fonctionnelles du cerveau à partir du modèle de souris pour étudier les mécanismes moléculaires de 1,2 rythmiques spontanées ou activités de l'événement du cerveau liées.
Acquisition de l'ensemble des canaux de la PBM-tableau est une condition nécessaire pour obtenir la cartographie du cerveau entier, toutefois en faire un contact sécurisé pour chaque canal est très difficile. Pour maintenir un contact constant de la chaîne sur le crâne, les procédures suivantes sont jugées importantes. Tout d'abord, tous les débris de tissu sur le crâne peut réserver l'électrode sur le crâne. Il est donc très important d'enlever tous les débris de tissus avec des tampons de coton stérilisé et sec jusqu'à la surface du crâne. Deuxièmement, la capacité des PBM-tableau qui peut coller à la surface du crâne est la force de van der Waals. Il est suggéré d'appliquer une goutte d'eau du robinet sur le crâne de construire la couche d'eau avant que l'on demande PBM-array au crâne. Troisièmement, la viscosité droit de ciment dentaire est très importante. Si elle est trop liquide, il peut construire une couche isolante sous la PBM-tableau. Si elle est trop dense, le ciment dentaire sera facilement s'effondrer à partir du crâne due à son propre poids. Enfin, au moins trois microscrews soutien devrait être implantée sur le crâne pour faire le ciment dentaire étroitement liée à la boîte crânienne. Le soutien microscrews retarder le ciment dentaire et sécuriser les headstage, qui est essentiel pour étude à long terme.
L'application de la PBM-array sera limitée à l'étude chronique avec des souris adultes en raison de sa taille et son poids. Basé sur notre expérience, les souris pesant plus de 25 g sont adéquats à utiliser. Comme d'autres applications, à travers l'espace nul entre les branches de nos PBM-tableau, on peut introduire des électrodes secondaires pour l'enregistrement ou l'objectif de stimulation.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Soutenu par le KIST Grant (2E21510), programme national scientifique d'honneur du ministère de l'Éducation et le Programme de technologie originale de recherche des sciences du cerveau à travers la recherche de la Fondation nationale de Corée financé par le ministère de l'Education, la Science et la Technologie (de 2010 à 0018944).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γbutyrolactone | Sigma-Aldrich | H7629-500G |
References
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
- Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).
