Summary
Deze methode beschrijft de generatie van organotypische cerebellaire culturen en het effect van bepaalde apoptotische stimuli op de levensvatbaarheid van de verschillende cerebellaire celtypen.
Abstract
Organotypische culturen van neuronaal weefsel werden voor het eerst geïntroduceerd door Hogue in 1947 1,2 en hebben gevormd een belangrijke doorbraak op het gebied van de neurowetenschappen. Sindsdien werd de techniek verder ontwikkeld en momenteel zijn er veel verschillende manieren om organotypische culturen te bereiden. De hier gepresenteerde methode werd aangepast van de ene beschreven door Stoppini et al.. Voor de voorbereiding van de plakken en van Gogolla et al.. Voor de kleuringsprocedure 3,4.
Een uniek kenmerk van deze techniek is dat het u toestaat om te studeren verschillende delen van de hersenen, zoals hippocampus of cerebellum in hun oorspronkelijke structuur, waardoor een groot voordeel ten opzichte van gedissocieerd culturen waarin alle cellulaire organisatie en neuronale netwerken zijn verstoord. In het geval van het cerebellum is het nog voordeliger omdat het toelaat de studie van de Purkinje cellen, zeer moeilijk te verkrijgen als gedissocieerd primaire cultuur. Deze methode kan worden gebruikt om bepaalde ontwikkelings-functies van het cerebellum in vitro onderzoek, evenals voor elektrofysiologische en farmacologische experimenten in zowel wild type en mutante muizen.
De hier beschreven methode werd ontworpen om het effect van apoptotische stimuli zoals Fas-ligand in de ontwikkelingslanden cerebellum onderzoek, met behulp van TUNEL kleuring tot apoptotische celdood te meten. Als TUNEL kleuring wordt gecombineerd met celtype specifieke markers, zoals de Calbindin voor Purkinje cellen, is het mogelijk om celdood te evalueren in een cel populatie specifieke manier. De Calbindin vlekken dient ook het doel van de evaluatie van de kwaliteit van de cerebellaire culturen.
Protocol
1. Organotypische Cerebellaire culturen:
- Om met succes het genereren van organotypische cerebellaire culturen gebruiken muizen tussen P0-P3 of P8-P12. Voor ons experiment gebruikten we muizen in de P8-P12 range omdat deze ontwikkelingsfase is meer geschikt voor ons onderzoek.
- Bereid de dissectie en het kweekmedium:
- Brain dissectie en slice voorbereiding worden uitgevoerd in een laag natriumgehalte Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met 1 mM calciumchloride, 10mm D-Glucose, 4mm kaliumchloride, 5mM magnesiumchloride, natriumbicarbonaat 26mm, 246mm sucrose en fenol rode oplossing (1:1000) , pH 7,3. Voor het steriliseren van de oplossing, filter het door een 0,22 um filter en bewaar bij 4 ° C.
- Cerebellaire plakjes worden gekweekt in 75% Minimum Essential Medium Eagle (MEM), 25% hitte-geïnactiveerd serum paard, 25mm HEPES, 1 mM glutamine, 5 mg / ml glucose, penicilline (100 U / ml) en streptomycine (100 U / ml). Filter het medium door een 0,22 um filter en bewaren bij 4 ° C voor een maximum van twee weken.
- Ontleden hersenen in ijskoude ACSF medium eerder borrelen met Carbogen (95% zuurstof en 5% kooldioxide) Let op, zal dat verzadiging met Carbogen veranderen de pH van de oplossing dus het zal verschuiven van rood naar oranje. De dissectie moeten worden uitgevoerd in het minimum van tijd mogelijk en let niet op de hersenstructuur schade.
- Snijd de hersenen in sagittale secties van 400 urn met behulp van een vibratome.
- Maak een sagittale snijden met een scheermesje in een halfrond, proberen om zo weinig mogelijk van de kleine hersenen gesneden, dit zal een vlakke ondergrond voor het snijden te bieden. De cortex wordt alleen gebruikt voor ondersteuning om het snijden makkelijker, maar omdat de tijd is een belangrijke kwestie is het handiger uit te snijden de rostrale helft van de cortex met een scheermesje.
- Gebruik cyanoacrylaat (Superlijm) om de positie van de hersenen vast op de metalen vibratome plaat. Het is belangrijk om de plaat op het ijs chill voor het toevoegen van de lijm en goed verspreiden met behulp van de punt van de buis om een dunne lijmlaag te vormen. Als er een overmaat van Superlijm, zal het los van de plaat als het in contact komt met de ACSF en het monster zullen verloren gaan.
- Zodra de hersenen is bevestigd aan de vibratome plaat, voeg genoeg ACSF media om de hersenen te dekken en het ijs zet onder het bord te houden het koud.
- Snijd 400 micrometer plakjes en breng ze met een plastic Pasteur pipet (snijd de tip om het te verbreden en te voorkomen dat schade aan het plakken) om een 6-well celkweek plaat met ACSF op ijs.
- Scheid de kleine hersenen van de rest van de hersenen met behulp van twee insulinespuiten (spuiten met een kleine diameter 28-gauge naalden) onder de microscoop te ontleden. Sommige schijfjes zullen Superglue aan de randen: dit is het moment om te proberen om hem te verwijderen als het kan de levensvatbaarheid van de slice beïnvloeden. Het is belangrijk om zorgvuldig te doen zonder schade aan de cerebellaire structuur.
- Breng de plakjes cerebellaire tot 6-well platen met 30mm cultuur plaat wisselplaten met 0,4 um poriën. Voeg 1 mL van de cultuur media per goed, dat was door de pre-incubatie gedurende ten minste 2 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 (in de celkweek incubator). Plaats de inzetstukken op de top van de media om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen ingesloten onder en vervolgens de cerebellaire plakjes (1-3 per insert) plaats op de top van de inserts ervoor te zorgen dat ze zijn volledig uitgebreid en dat er geen vloeistof is ze te bedekken. Aspireren overmaat van media als dat nodig is. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 het veranderen van de cultuur van media om de 2 of 3 dagen. Het beste is om slechts een gedeelte van het medium (bijv. ½ volume) te vervangen in een keer, aangezien de gebruikte medium bevat slice-afgeleide trofische factoren die belangrijk zijn voor overleving van de cel.
2. Fas behandeling en kleuring van Cerebellaire Slices:
- Voor de apoptotische uitdaging experiment, moeten we eerst de cultuur van de schijfjes gedurende 5 dagen veranderen van media op dag 3 in vitro (DIV3). Op DIV5 culturen zijn behandeld met 0,5 ug / ml van de Fas agonist antilichaam Jo2 door het toevoegen van het direct aan de media om een schone achtergrond van celdood hebben sinds de veranderingen van de media kunnen leiden tot een aantal sterfte in de culturen. De helft van de putten worden niet behandeld als controlegroep.
- Na 24 uur verwijdert u de media onder de inserts door zuiging. Om vast te stellen de plakjes, voeg 1 ml ijskoude 4% PFA onder en 1 ml boven de insert. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Na 10 minuten verwijderd van de PFA en spoel kort met koud PBS.
- Volgende verwijder de PBS en voeg 1 ml onder en 1 ml boven de insert van 20% ijskoud methanol in PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was opnieuw met PBS en voeg 1 ml onder en 1 ml boven de insert van 0,5% Triton-X-100 in PBS voor permeabilisatie. Incubeer voor een minimum van 12 uur bij 4 ° C.
- Na permeabilisatie, blok met 20% BSA in PBS voor een minimum van4 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. In dit stadium van de schijfjes kan worden gehouden in het blokkeren van oplossing voor ten minste 3 dagen bij 4 ° C.
- Om vlekken op de plakjes voorzichtig het stukje van het membraan gesneden te voegen aan de cerebellaire slice en overbrengen naar 24-well platen met PBS.
- De immunokleuring is sequentieel gedaan, eerst met TUNEL reagens voor een uur en dan met Calbidin antilichaam 's nachts.
- Zuig het PBS en voeg 250 ul uit TUNEL reagens in elk putje en zorg ervoor dat beslaat de hele oppervlakte van de slice. Incubeer bij 37 ° C gedurende een uur in het donker.
- Na een uur verwijderd van de TUNEL mix en wassen met PBS drie keer voor 10 minuten.
- Na de laatste wasbeurt, verwijder de PBS en voeg 250 ui van een 1 / 1000 verdunning van de Calbindin antilichaam in PBS en incubeer overnacht bij 4 ° C in het donker.
- Verwijder het primaire antilichaam oplossing en wassen met PBS drie keer voor 10 minuten.
- Voeg 250 ul van secundair antilichaam verdund 1 / 500 in PBS en incubeer gedurende ten minste drie uur bij kamertemperatuur in het donker. De TUNEL kit we gebruikten is gemerkt met TMR rood, dus onze tweede antilichaam voor Calbindin is geconjugeerd aan Alexa-488.
- Was driemaal gedurende 10 minuten met PBS en monteer de plakjes op een glazen microscoopglaasje met behulp van een montage media DAPI bevat.
- Het imago van de plakjes met een confocale microscoop met behulp van de 488 nm en 561 nm excitatie golflengte voor Calbindin en TUNEL respectievelijk.
3. Representatieve resultaten:
De belangrijkste uitdaging van dit protocol is om te kunnen gezond cerebellaire slice culturen te genereren, vooral sinds onze laatste uitlezing zal celdood worden. Een gezonde cultuur verschijnt als een waar de cel lichaam laag is doorzichtig en laat u zien dat de gelaagde structuur van het cerebellum onder de microscoop (zie figuur 1). Na een paar dagen in de cultuur van de plakjes beginnen te dun en niet-neuronale cellen kan worden waargenomen migratie uit de buurt van de marge van de slice. De donkere ronde cellen (waarschijnlijk macrofagen) dat de schijfjes te dekken na een paar dagen in cultuur, zal uiteindelijk daling van het aantal na 10-14 dagen in vitro (figuur 2) 5. Het ultieme bewijs voor de levensvatbaarheid van de schijfjes is het vlek voor de verschillende cellulaire merkers, zoals Calbindin voor de Purkinje-cellen. Figuur 3 toont een vertegenwoordiger confocale microscoop beeld van de Purkinje cel laag met een aantal TUNEL positieve kernen.
Het is belangrijk aan te nemen dat zelfs wanneer sommige plakken kregen een apoptotische stimulus, ze alleen werden blootgesteld gedurende 24 uur. Deze voldoende tijd krijgen om DNA-fragmentatie observeren in de stervende cellen met de TUNEL kleuring, maar een bepaald Purkinje cel laag was nog steeds aanwezig.
Figuur 1. Gezonde cerebellaire slice op DIV2. Deze afbeelding toont de doorschijnende cellichaam laag en de gelaagde structuur van het cerebellum in een gezond slice.
Figuur 2. Gezonde cerebellaire slice bij DIV 7. In dit beeld kunnen we nog steeds de gelaagde structuur van het cerebellum en de verschijning van donkere cellichamen observeren.
Figuur 3. Representatief beeld van een Fas-behandelde cerebellaire slice. Confocale Deze afbeelding toont de Purkinje-cellen gekleurd met Calbindin (groen) en de apoptotische cellen positief voor TUNEL kleuring (rood). Purkinje cellen worden niet weergegeven in een enkele rij, maar zijn geclusterd het vormen van een folium-achtige structuur.
Discussion
Deze methode beschrijft een van de vele mogelijke toepassingen van neuronale organotypische culturen en het heeft ons toegestaan om het effect van apoptotische stimuli studie in wild-type en mutant cerebellaire plakjes.
Het meest kritische deel van dit experiment is om te kunnen consequent genereren van gezonde cerebellaire slice culturen. De belangrijkste factoren zijn dissectie en snijden techniek en de mogelijkheid om het protocol uit te voeren in de kortst mogelijke tijd, maar tegelijkertijd zorg dat u de plakjes schade. Een andere cruciale factor is de voorbereiding en samenstelling van de kweekmedia, deze culturen zijn erg gevoelig, dus moesten we een aantal recepten en merken van de media te testen. Zelfs verschillende batches van serum of een andere onderdelen van de media invloed kunnen zijn op de levensvatbaarheid van de schijfjes. We hebben de beste resultaten met het Paard Serum van Invitrogen Lot # 480116.
Zodra de cerebellaire schijfjes worden gegenereerd men kan studeren cerebellaire ontwikkeling, elektrofysiologie, overleving van de cel alleen of in reactie op apoptotische stimuli, excitotoxiciteit of zuurstoftekort. Vergelijkende studies met behulp van wild type en mutante cerebellaire schijfjes zijn zeer verhelderend in vele aspecten van de kleine hersenen en de ontwikkeling.
Disclosures
Alle dieren uitgevoerd werk werd gedaan in overeenstemming met het beleid van de IACUC. Het Salk Institute is een AAALAC geaccrediteerde faciliteit.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd deels gefinancierd door de IPSEN Foundation. IMV is een American Cancer Society hoogleraar Moleculaire biologie, en houdt de Irwin en Joan Jacobs leerstoel Voorbeeldige Life Sciences. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de NIH, Leducq Foundation, Meriaux Stichting, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, en de HN-en Frances C. Berger Foundation. PAS wordt gefinancierd door McKnight Endowment Fund voor Neurowetenschappen en het National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). De auteurs willen graag aan Mark Schmitt bedanken. Grafische kunst werd ontworpen door Jamie T. Simon. Sponsoring werd vriendelijk verschaft door Invitrogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
