Organotypic अनुमस्तिष्क संस्कृति: apoptotic चुनौतियां और जांच
Summary
इस विधि organotypic अनुमस्तिष्क संस्कृतियों की पीढ़ी के और अलग अनुमस्तिष्कीय सेल प्रकार की व्यवहार्यता पर कुछ apoptotic उत्तेजनाओं के प्रभाव का वर्णन करता है.
Abstract
Neuronal ऊतक की Organotypic संस्कृतियों पहले +१,९४७ 1,2 में थे Hogue द्वारा शुरू की है और तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में एक बड़ी सफलता का गठन. तब से, तकनीक और आगे विकसित किया गया था और इस समय वहाँ कई अलग अलग तरीके हैं organotypic संस्कृतियों तैयार है. विधि यहाँ प्रस्तुत Stoppini एट अल द्वारा वर्णित एक से अनुकूलित किया गया था स्लाइस की तैयारी के लिए और Gogolla एट अल से धुंधला 3,4 प्रक्रिया के लिए..
इस तकनीक की एक अनूठी विशेषता यह है कि यह आप हिप्पोकैम्पस या उनके मूल संरचना में सेरिबैलम जैसे मस्तिष्क के विभिन्न भागों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, अलग संस्कृतियों में सभी सेलुलर संगठन और neuronal नेटवर्क बाधित कर रहे हैं पर एक बड़ा लाभ प्रदान. सेरिबैलम के मामले में यह और भी अधिक लाभप्रद है क्योंकि यह Purkinje कोशिकाओं के अध्ययन, अत्यंत dissociated प्राथमिक संस्कृति के रूप में प्राप्त करना कठिन अनुमति देता है. इस विधि के लिए इन विट्रो में सेरिबैलम के कुछ विकासात्मक सुविधाओं का अध्ययन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दोनों जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती चूहों में electrophysiological और औषधीय प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
विधि यहाँ वर्णित किया गया था जैसे विकासशील सेरिबैलम में फैस ligand apoptotic उत्तेजनाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन, TUNEL के धुंधला हो जाना का उपयोग करने के लिए apoptotic कोशिका मृत्यु को मापने. यदि TUNEL के धुंधला कोशिका प्रकार Calbindin जैसे विशिष्ट, Purkinje कोशिकाओं के लिए मार्कर के साथ संयुक्त है, यह संभव है के लिए एक सेल की आबादी विशिष्ट तरीके में कोशिका मृत्यु का मूल्यांकन. Calbindin धुंधला हो जाना भी अनुमस्तिष्क संस्कृतियों की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से कार्य करता है.
Protocol
Discussion
इस विधि neuronal organotypic संस्कृतियों के कई संभावित अनुप्रयोगों में से एक का वर्णन करता है और यह हमें जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती अनुमस्तिष्क स्लाइस में apoptotic उत्तेजनाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति दी गई है.
इस प्रयोग का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा लगातार स्वस्थ अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों उत्पन्न करने में सक्षम होना है. महत्वपूर्ण कारक विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक और कम से कम संभव समय में प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने की क्षमता है, लेकिन एक ही समय में सावधान किया जा रहा नुकसान नहीं स्लाइस. एक अन्य महत्वपूर्ण कारक और संस्कृति मीडिया की तैयारी संरचना है, इन संस्कृतियों बहुत संवेदनशील होते हैं, इसलिए हम मीडिया के कई व्यंजनों और ब्रांडों का परीक्षण किया था. यहां तक कि सीरम या मीडिया के किसी भी अन्य घटकों के विभिन्न बैचों स्लाइस की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है. हम Invitrogen लूत # 480116 से हार्स सीरम के साथ सबसे अच्छा परिणाम मिला है.
एक बार अनुमस्तिष्क स्लाइस उत्पन्न कर रहे हैं एक अनुमस्तिष्क विकास, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, सेल अस्तित्व अकेले या apoptotic उत्तेजनाओं, excitotoxicity या ऑक्सीजन के अभाव के जवाब में अध्ययन कर सकते हैं. तुलनात्मक जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती अनुमस्तिष्क स्लाइस का उपयोग कर पढ़ाई बहुत व्यावहारिक अनुमस्तिष्क समारोह और विकास के कई पहलुओं में किया गया है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में भाग Ipsen फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था. IMV आण्विक जीवविज्ञान की एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी के प्रोफेसर, और अनुकरणीय लाइफ साइंसेज में इरविन और Joan याकूब चेयर रखती है. इस काम के हिस्से में एनआईएच, Leducq फाउंडेशन, Meriaux फाउंडेशन, एलिसन मेडिकल फाउंडेशन, Ipsen / Biomeasure, Sanofi एवेंटिस, प्रोस्टेट कैंसर फाउंडेशन, और हेमवती और फ्रांसिस सी. बर्गर फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. पीए McKnight तंत्रिका विज्ञान और नशीली दवाओं के सेवन पर राष्ट्रीय संस्थान (DA019022 R01) के लिए बंदोबस्ती कोष द्वारा वित्त पोषित है. लेखकों मार्क श्मिट को धन्यवाद देना चाहूंगा. ग्राफिक कला जेमी टी. साइमन द्वारा डिजाइन किया गया था है प्रायोजन कृपया Invitrogen द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM | Invitrogen | 11090 | ||
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
| Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
| Superglue | Krazy Glue | |||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
| Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
| Vibratome | Leica | |||
| Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T., Banker, G., Goslin, K. . Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. , 461-498 (1998).
