이 문서는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브 리다이 제이션과 임상 설정에서 미리 주입 유전자 진단 (PGD)에 적용되는 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.
사전 이식 유전 진단 (PGD)은 사전 산후 진단하기 위해 설립된 대안이며, 보조 생식 기술 (ART)에 의해 생성된 일대에서 미리 주입 배아를 선택 포함됩니다. 이 선택 때문에 가족 monogenic 질환 (예 : 낭성 섬유증)의 요구, 혹은 파트너가 염색체 다시 정리하기 (예 : 양방향 상호의 translocation) 수행하기 때문에 수 있습니다. PGD는 염색체 rearrangements, 재발성 유산이나 불임의 경우에는 이전의 영향을받는 아이가, 그리고 / 또는이 커플에 사용할 수 있습니다. Oocytes는 다음과 난소 자극이 정액의 체외의 집중 (IVF)에 의해 또는 개별 정자 (ICSI)의 intracytoplasmic 주입에 의해 수정된 아르 aspirated. 사전 주입 절단 단계의 배아는 보통 3 일 후 수정에 대한 단일 세포의 제거에 의해 biopsied 있으며, biopsied 세포는 배아의 유전자 상태를 설정하는 테스트입니다. 대상 – 특정 DNA 프로브와 함께 biopsied 세포의 고정 핵에 원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광가있는 X – 링크된 질환과 염색체 rearrangements과 관련된 염색체 불균형을 감지하고, 가족 여성 배아를 선택하는 선택의 기술이다 더 돌연변이없는 특정 테스트합니다. 물고기도 지원 복제의 효율성을 시도하고 개선하기 위해 자발적인 염색체 aneuploidy (또한 PGS 또는 PGD – AS라고도 함)에 대한 화면 배아하는 데 사용되었습니다 있지만, 확산 및 생선 기술을 사용하여이 검사의 예측 가치는 여기에 설명된 대부분의 사람의 손에 unacceptably 낮은 가능성이 높습니다 그리고 그것은 일상적인 임상 사용하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브리드화에서 임상 환경에서 PGD에 적용 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.
하나의 배아 세포 (blastomere)에 원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광의 응용 프로그램 practicalities 및 신호 패턴의 해석에 모두 특별한 도전을 선물한다. biopsied 세포는 현지화 다음 물고기를 촉진하기 위해 슬라이드에 사전 정의된 영역 내에서 전파해야, 극단적인 치료는 세포는 세포질이 분산되었다는, lysed입니다 확보에 주의할 필요하고, 그 핵 진단이 단일 셀, 엄격한 채점과 해석 지침이 적용되어야의 결과에 따라로서, 그리고, 보이는 그대로입니다. 그러나, 경험 손으로, 물고기는 임상 연습에 미리 주입 유전자 진단 (PGD)를위한 강력한 기법입니다. 물고기에 의해 PGD의 원리는 다른 fluorochromes 또는 haptens으로 표시 대상 특정 DNA 프로브는 특정 loci의 사본 번호를 검색하는 데 사용할 수있는 것이 있으며, 따라서 Robertsonian 포함한 염색체 rearrangements의 meiotic 분리 (1)과 관련된 염색체 불균형을 감지하는 translocations, 상호 translocations, 뒤집어, 복잡한 rearrangements (2). 생선도 더 돌연변이 특정 시험 (3, 4)가없는있는, X – 연결된 질환으로 가정에서 여성의 배아를 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 더 controversially, 생선도 도움을 재생산 (5, 6)의 효율성을 시도하고 개선하기 위해 산발적 염색체 aneuploidy을위한 화면으로 사용되었습니다 있지만, FSIH를 사용하여이 테스트의 예측 가치에 unacceptably 낮은 될 가능성이 높습니다 대부분의 사람들이 손과 그것은 일상적인 임상 사용 (7)하지 않는 것이 좋습니다. 이 문서는 임상 단일 세포 진단에 적용 물고기의 기술적 측면과 한계에 중점을두고 있습니다.
단일 blastomeres을 전파하고 고칠 수있는 방법은 메탄올 / 초산 (5, 8), 트윈 / HCL (9), 그리고 트윈 / HCL과 메탄올 / 초산 (10)의 조합을 포함합니다. 유사 이전에 고정 후 및 / 또는 펩신과 paraformaldehyde 치료 확산에 셀 hypotonic 치료를 포함합니다. 방법을 적절히 실험실 (14)에 대한 검증해야합니다. 트윈 / HCL 방법은이 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 트윈 / HCL 방법은 다른 실험실에서 기술적으로 단순하고 고도로 재현할 수 있습니다. 이 방법은 허용 진단 정확도 (7) 섹스 결정 및 염색체 rearrangements의 생선 진단을위한 단일 핵을 준비하는 데 사용할 수 있습니다.
프로브의 혼합은 다른 제조 업체의 프로브와 프로브를 직접 표시하고 간접적으로 표시 결합할 수 있습니다. 생식 파트너 모두에서 사전에 테스트하여 PGD에 대한 구체적이고 적합으로 표시하는 경우 사용할 수 있지만 알려진 다형성 염색체 영역에 대한 프로브 (11, 12), 또는 다른 염색체 (13)와 함께 상당히 상호 잡종으로 알려진 사람은 피해야한다 . 차별 프로브를 사용할 수 fluorochromes / haptens과 전략은 다음과 같습니다 텍사스 레드 (TR), 플루오레신 isothiocyanate (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, TR – 아비딘로 검색 biotinylated 프로브, FITC – 아비딘, 또는 싸이 – 5 streptavidin (FarRed 필터를 사용하여 시각), 노란색 신호, 하이브 리다이 제이션의 두 번째 라운드와) TexasRed과 SpectrumGold 필터를 사용 SpectrumOrange의 연속 캡처 만든 삼분의 일 색상을 생성하는 적색과 녹색의 프로브를 섞는다.
X와 Y 염색체와 autosome 하나의 centromere 지역에 대한 구체적인 세 프로브를 포함하는 프로브 세트, 성별 결정 (14)을 권장하며 autosomal 프로브 (2N, 47 trisomy X를 구분하는 ploidy함으로써 구축하는 데 사용됩니다 , XXX)와 triploidy (3n, 69, XXX), 그리고 tetrasomy X (48, XXXX)과 tetraploidy (4N, 92, XXXX) 사이. 이 프로브 설정은 매우 낮은 다형성 비율을 가지고 시연되었으며, 따라서 전처리 작업 – 최대 생식 파트너, 전형적인 프로브는 알파 – 위성 X, Y, 18을 포함하고있는 애보트 AneuVysion 믹스는이 설정을 적용으로 설정 (14) 필요하지 않습니다.
특정 다시 정리하기위한 프로브 혼합합니다 이상적으로 염색체 불균형으로 다시 정리하기의 모든 예상 제품을 감지하는 적어도 충분한 프로브를 포함하고 있습니다. 이것이 불가 능할 경우, 프로브는 들키지 불균형 제품이 인식 임신이 아닌 실용적으로 평가하고 매우 낮은 유행이 (14) 허용 수 있습니다 가질 가능성이 어디에 있었는지 혼합. 모두 생식 파트너 교양 림프구 metaphases에서 테스트한다. 적어도 열 metaphase 확산은 프로브과 같이 다시 정리하기의 다른 세그먼트에 예상을 잡종 수 있도록 프로브 특이성, polymorphisms 및 교차 하이브 리다이 제이션에 대한 검사, 그리고 염색체 다시 정리하기 캐리어 위해해야합니다. 또한, 이러한 준비에서 최소한 100 계면 핵은 신호 특이성, 밝기, 그리고 discreteness (14)을 평가하기 위해 득점해야합니다.
Commercial PGS 프로브 세트 사용할 수 있습니다 (예 : 애보트 MultiVysion PB 또는 PGT), 자주 개념의 제품 aneuploid 수있는 염색체를 대상으로하고, 대상 염색체 당 하나의 프로브로 구성된. 일반적으로 핵은 염색체 13, 15, 16, 18, 21, 22, 그리고 XY (14)에 대한 분석을 제공하는 추가적인 염색체를위한 탐사선과 두 번째 하이브리드화가있을 수 있습니다. 확산 및 생선 기술은 여기에 설명된를 사용하여이 테스트의 예측 가치는 대부분의 사람의 손에 unacceptably 낮은 가능성이 높습니다 그리고 그것은 일상적인 임상 사용 (7, 15)을 위해 사용하지 않는 것이 좋습니다.
이러한 단일 세포에 적용 비교 게놈의 하이브 리다이 제이션 (CGH)로 기술 (2001. 윌턴 외) 모든 염색체의 사본 번호를 테스트 할 수 있으며, 단일 염기 polymorphisms의 사용 (SNP)는 배열과 정량 분석 (웰스 외 . 2008) 또는 "karyomapping"genotyping은 (핸디 외. 2009) 염색체 aneuploidy을 감지하는 대안 기법을 약속하고 있습니다. 그러나, 세그먼트 불균형에 대한 해결 한도와 정확도가 불확 실한 남아 그것은 물고기가 작은 세그먼트를 포함하는 염색체 rearrangements을위한 최고의 기술로 지속 가능성이 높습니다.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Hydrochloric Acid, 2.5L | VWR | 101254H | ||
Sodium Chloride, 5Kg | VWR | 443827W | ||
Potassium Chloride, 250g | VWR | 26764.232 | ||
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g | VWR | 102494C | ||
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g | VWR | 10203 4B | ||
Sodium Hydroxide Pellets, 500g | VWR | 28245.265 | ||
Tween20, 500mL | VWR | 663684B | ||
Ethanol, 2.5L | VWR | 8.18760.2500 | Duty Paid | |
Tri-Sodium Citrate, 5Kg | VWR | 27833.363 | ||
Cow Gum, 250mL | Cow Proofings Ltd. | No longer available | Old stocks can still be found in art shops | |
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul | Cytocell | DES500L | 150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe | |
Nail Varnish, 12mL | Boots | 10088316001 | ||
Amine-coated Slides, 25 | Genetix | K2615 | ||
DAPI, 0.1mL | Sigma-Aldrich | D-9542 | ||
Vectashield, 10mL | Vector Laboratories | H1000 | ||
Texas-Red-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2016 | ||
FITC-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2011 | ||
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL | GE Healthcare | PA45001 | ||
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500 | Thistle Scientific | AX-MCT-175-C | ||
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000 | Thistle Scientific | AX-MCT-060-C-CS | ||
30ml Universal Containers, box of 400 | Sterilin | 128B | Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053 | |
Hot Block | ||||
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick |
VWR VWR VWR |
451-0107 451-3112 451-3111 |
||
Plugged Glass Pipettes | Fisher Scientific | PMK-300-052R | ||
Dissecting Microscope | Wild Heerbrugg | |||
Tissues, 100boxes | NHS SUPPLY CHAIN | MJT058 | ||
Metal Culture Trays | ||||
Plastic Melamine Trays | VWR | 682-009 | ||
Oven | ||||
Mouth Pipette Mouthpiece | Scientific Laboratory Supplies | HAE3700 | ||
Tubing | ||||
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter | Fisher Scientific | FDM-340-010U | ||
Diamond Pen | VWR | 818-0021 | ||
Hot Block for Slides | Thermo Hybaid | HBOSBB | ||
Hybridization Chamber | ||||
Tissue Roll | NHS SUPPLY CHAIN | MJT004 | ||
Schieferdecker Jar | VWR | 631-9313 | ||
Coplin Jar | VWR | 631-9331 | ||
Forceps, Fine | VWR | 232-2123 | ||
Forceps, Blunt | VWR | 232-2113 | ||
1000mL Beaker | VWR | 213-1642 | ||
Phase Contrast Microscope | Nikon | E200 | ||
Fibre-free Blotting Cards, box of 100 | Fisher Scientific (Raymond Lamb) | SDE1 | ||
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3022 | ||
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3110 | ||
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3104 | ||
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3206 | ||
1mL Syringe, box of 100 | NHS Supply Chain | FWC045 | ||
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000 | Thistle Scientific | AX-T-1000-C-L-R | ||
Incubator | LEEC | |||
Waterbath | Grant | W22 | ||
Alcohol Thermometer | Various sources available | |||
pH Meter | Jenway | 3305 | ||
pH Electrode | VWR | 662-1759 | BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305 | |
Heated Stirrer | Bibby | HC502 | ||
1mL Pasteur Pipettes, box of 500 | Scientific Laboratory Supplies | PIP4202 | ||
Parafilm, 50mm x 75m | VWR | 291-1214 |