本文介绍了单细胞的鱼,卵裂球核的传播技术,原位杂交和信号的得分,在临床上的应用植入前遗传学诊断(PGD)选择合适的探头。
植入前遗传学诊断(PGD)是一个既定的替代产前诊断,涉及选择植入前胚胎,辅助生殖技术(ART)生成一个队列。这种选择可能是必要的,因为家族的单基因疾病(如囊性纤维化),或因为一个合作伙伴进行的染色体重排(例如一个双向的相互易位)。 PGD是谁曾以前影响的儿童,和/中的染色体重排,习惯性流产或不孕的情况下,或夫妇。卵母细胞吸气以下卵巢刺激浸泡在精液在体外 (试管婴儿),或由单个精子胞浆内注射(ICSI)的受精。通常是由一个单细胞受精后第3天的清除,植入前胚胎卵裂期活检,活检细胞测试,以确定胚胎的遗传地位。荧光原位杂交(FISH)技术活检细胞与特定目标的DNA探针固定核是首选的技术检测染色体不平衡染色体重排,并与X -连锁的疾病有选择家庭中的女性胚胎没有突变,具体的测试。鱼也被用于屏幕胚胎自发的染色体非整倍体(又称PGS或PGD – AS),以尝试和改进辅助生育的效率;然而,这次试验的预测值,使用的传播和FISH技术在这里描述可能低得无法接受,在大多数人的手中,这是不推荐用于临床常规使用。我们描述了单细胞的鱼,卵裂球核的传播技术,原位杂交和信号打分以胚胎植入前诊断,在临床上应用选择合适的探头。
应用荧光原位杂交(FISH),以一个单一的胚胎细胞(卵裂球)提出了特殊的挑战,无论是在实用性和信号模式的解释。幻灯片上的预先设定的区域内传播,以促进其本地化以下的鱼;活检细胞需要格外小心,需要采取的确保,细胞裂解,细胞质已经分散,和细胞核是可见的和完整的;,诊断从这个单细胞,严格评分和解释准则应适用的结果而定。然而,对于有经验的,鱼是一个强大的技术在临床实践中植入前遗传学诊断(PGD)。 PGD的鱼的原则,具体目标不同的荧光染料或半抗原的DNA标记的探针,可用于检测的特异位点的拷贝数,并以此来检测染色体减数分裂染色体重排的隔离(1)相关的不平衡,包括罗伯逊易位,相互易位,倒置,和复杂的重排(2)的。鱼也可以用来选择与X染色体连锁的疾病的女性在家庭中的胚胎,其中有没有特定的基因突变试验(3,4)。更有争议的是,鱼也被用于筛选零星的染色体非整倍体,以尝试和改进辅助繁殖(5,6)的效率;然而,预测值这个使用FSIH测试是可能到是低得无法接受在大多数人的的手,这是不推荐用于临床常规使用(7)。本文集中在技术方面和鱼应用于临床诊断的单细胞的局限性。
传播和操纵单个卵裂球的方法,包括甲醇/醋酸(5,8),吐温/盐酸(9),吐温/ HCl和甲醇/乙酸(10)的组合。变化包括低渗处理细胞固定后蔓延和/或胃蛋白酶和多聚甲醛处理。该方法应适当验证实验室(14)。吐温/盐酸的方法是在这篇文章中详细描述。吐温/盐酸的方法是技术上简单,在不同实验室的高度重复性。这种方法可以用来准备的性别鉴定和染色体重排与可接受的诊断准确率(7)鱼诊断的单核。
探针混合物可以结合直接标记和间接来自不同制造商的标记,探针和探头。已知多态性染色体区域的探头(11,12),或与其他染色体(13)显着交叉杂交的的应该是可以避免的,虽然可以使用,如果显示为PGD的具体和适当的生殖伙伴都事先测试。歧视探头可用荧光/半抗原和战略包括以下内容:德克萨斯红(TR),异硫氰酸荧光素(FITC),SpectrumGreen(Vysis),SpectrumOrange(Vysis),SpectrumAqua,TR – 亲和素检测生物素标记探针,FITC标记的抗生物素蛋白,或CY – 5链霉亲和素(可视化使用FarRed的过滤器),红色和绿色的探头的组合,以产生一种黄色信号,杂交的第二轮和第三个颜色由SpectrumOrange使用一个TexasRed和SpectrumGold过滤器)连续捕捉创建。
性别决定(14)一个探针组,其中包含三个探针,X和Y染色体和一个常染色体着丝粒区域的具体建议;常染色体探针是用来建立套数,从而区分三体综合征的X(2N,47 XXX)和三倍体(3N,69,XXX),四体X(48,XXXX)和四倍体(4N,92,XXXX)之间。一个典型的探头设置,此设置适用于含有α-卫星的X,Y,18雅培AneuVysion混合,这种探头设置已被证明有一个非常低的多态性利率,并因此治疗前的生殖伙伴工作不需要(14)。
任何特定重排的探头组合:理想情况下含有至少有足够的探测器检测到所有的染色体不平衡重排的预期产品。如果这是不可能的,探头混合未被发现的不平衡产品已被评定为在一个公认的妊娠非可行的,并可能有非常低发病率是可以接受的的(14)的。生殖伙伴培养淋巴细胞中期进行测试。应至少有10个中期利差特异性探针,基因多态性和交叉杂交研究,染色体重排载体,以确保探针杂交有望重排的不同环节。此外,这些准备工作至少有100间期核应取得评估信号的特殊性,亮度和离散(14)。
COMMErcial PGS的探头套(如雅培MultiVysion PB或PGT),针对最经常发现,在受孕的产品非整倍体的染色体,包括每个染色体的单探头针对性。通常细胞核内可能有一个与第二个杂交探针检测染色体13,15,16,18,21,22,XY(14)提供一个额外的染色体。本测试使用的蔓延,这里描述的FISH技术的预测值可能低得无法接受,在大多数人的手中,这是不推荐用于临床常规使用(7 15)。
如适用于单核细胞的比较基因组杂交(CGH)技术能够测试每一个染色体的拷贝数(威尔顿等2001),并利用单核苷酸多态性(SNP)的阵列和定量分析 ( Wells等2008)或“karyomapping”基因分型(Handyside 等人,2009年),是很有前途的替代技术来检测染色体非整倍体。但是,分辨率的限制和段失衡的准确性仍然不明朗,这是有可能,鱼类将继续涉及小段的染色体重排的首选技术。
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Hydrochloric Acid, 2.5L | VWR | 101254H | ||
Sodium Chloride, 5Kg | VWR | 443827W | ||
Potassium Chloride, 250g | VWR | 26764.232 | ||
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g | VWR | 102494C | ||
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g | VWR | 10203 4B | ||
Sodium Hydroxide Pellets, 500g | VWR | 28245.265 | ||
Tween20, 500mL | VWR | 663684B | ||
Ethanol, 2.5L | VWR | 8.18760.2500 | Duty Paid | |
Tri-Sodium Citrate, 5Kg | VWR | 27833.363 | ||
Cow Gum, 250mL | Cow Proofings Ltd. | No longer available | Old stocks can still be found in art shops | |
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul | Cytocell | DES500L | 150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe | |
Nail Varnish, 12mL | Boots | 10088316001 | ||
Amine-coated Slides, 25 | Genetix | K2615 | ||
DAPI, 0.1mL | Sigma-Aldrich | D-9542 | ||
Vectashield, 10mL | Vector Laboratories | H1000 | ||
Texas-Red-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2016 | ||
FITC-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2011 | ||
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL | GE Healthcare | PA45001 | ||
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500 | Thistle Scientific | AX-MCT-175-C | ||
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000 | Thistle Scientific | AX-MCT-060-C-CS | ||
30ml Universal Containers, box of 400 | Sterilin | 128B | Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053 | |
Hot Block | ||||
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick |
VWR VWR VWR |
451-0107 451-3112 451-3111 |
||
Plugged Glass Pipettes | Fisher Scientific | PMK-300-052R | ||
Dissecting Microscope | Wild Heerbrugg | |||
Tissues, 100boxes | NHS SUPPLY CHAIN | MJT058 | ||
Metal Culture Trays | ||||
Plastic Melamine Trays | VWR | 682-009 | ||
Oven | ||||
Mouth Pipette Mouthpiece | Scientific Laboratory Supplies | HAE3700 | ||
Tubing | ||||
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter | Fisher Scientific | FDM-340-010U | ||
Diamond Pen | VWR | 818-0021 | ||
Hot Block for Slides | Thermo Hybaid | HBOSBB | ||
Hybridization Chamber | ||||
Tissue Roll | NHS SUPPLY CHAIN | MJT004 | ||
Schieferdecker Jar | VWR | 631-9313 | ||
Coplin Jar | VWR | 631-9331 | ||
Forceps, Fine | VWR | 232-2123 | ||
Forceps, Blunt | VWR | 232-2113 | ||
1000mL Beaker | VWR | 213-1642 | ||
Phase Contrast Microscope | Nikon | E200 | ||
Fibre-free Blotting Cards, box of 100 | Fisher Scientific (Raymond Lamb) | SDE1 | ||
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3022 | ||
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3110 | ||
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3104 | ||
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3206 | ||
1mL Syringe, box of 100 | NHS Supply Chain | FWC045 | ||
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000 | Thistle Scientific | AX-T-1000-C-L-R | ||
Incubator | LEEC | |||
Waterbath | Grant | W22 | ||
Alcohol Thermometer | Various sources available | |||
pH Meter | Jenway | 3305 | ||
pH Electrode | VWR | 662-1759 | BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305 | |
Heated Stirrer | Bibby | HC502 | ||
1mL Pasteur Pipettes, box of 500 | Scientific Laboratory Supplies | PIP4202 | ||
Parafilm, 50mm x 75m | VWR | 291-1214 |