В этой статье описывается выбор подходящих зондов для одноклеточных FISH, распространение методов бластомеров ядер, и в гибридизация и сигнал скоринга, применительно к предимплантационной генетической диагностики (ПГД) в клинических условиях.
Доимплантационной генетическая диагностика (ПГД) является признанным альтернатива дородовой диагностики и включает в себя выбор предымплантационного эмбрионов из когорты порожденных помощью технологии воспроизводства (АРТ). Этот выбор может потребоваться из-за семейной болезни моногенных (например, кистозный фиброз), или потому, что один из партнеров осуществляет хромосомных перестроек (например, двусторонние взаимные транслокации). ПГД доступна для пар, которые уже раньше пострадавших детей, и / или в случае хромосомных перестроек, повторные выкидыши или бесплодие. Ооциты атмосферный после стимуляции яичников оплодотворяются в пробирке погружение в сперме (ЭКО) или интрацитоплазматической инъекция сперматозоида отдельные (ИКСИ). Доимплантационной расщепления стадии эмбрионы биопсии, как правило, путем удаления одной клетки на 3 день после оплодотворения, и биопсию ячейка испытания для установления генетического статуса эмбриона. Флуоресцентный в гибридизация (FISH) на фиксированную ядер биопсию клетки с мишень-специфической ДНК-зондов является методом выбора для выявления хромосом дисбаланс связан с хромосомными перестройками, а также выбрать женских эмбрионов в семьях с Х-сцепленным заболеванием, для которого существует никакая мутация конкретного теста. FISH была также использована для скрининга эмбрионов для спонтанной анеуплоидии хромосомы (также известный как PGS или PGD-AS), с тем чтобы попытаться улучшить эффективность искусственного оплодотворения, однако прогностическая ценность этого теста с использованием распространения и FISH методике, описанной здесь скорее всего, будет неприемлемо низкой в руках большинства людей и не рекомендуется для рутинного клинического использования. Мы опишем выбор подходящих зондов для одноклеточных FISH, распространение методов бластомеров ядер, и в гибридизация и сигнал скоринга, применительно к ПГД в клинических условиях.
Применение флуоресценции в гибридизация (FISH) в одной клетке эмбриона (бластомеров) представляет особых проблем, как в практической, а в интерпретации сигнала узор. Биопсию ячейки необходимо распространять в пределах заранее определенной зоны на слайде с тем чтобы облегчить ее локализации следующим рыбы; особой осторожностью следует принимать в том, чтобы ячейка лизированными, что цитоплазма была рассеяна, и, что ядро видна и нетронутыми, и, как диагноза зависит от результатов этой единственной клетки, строгие по подсчету и интерпретации руководящие принципы должны быть применены. Тем не менее, в опытных руках, FISH это мощная техника для предимплантационной генетической диагностики (ПГД) в клинической практике. Принцип ПГД рыбой в том, что мишень-специфической ДНК проб, соединенных с различными флуорохромами или гаптенов могут быть использованы для обнаружения копию ряд конкретных локусов, и таким образом обнаружить хромосому дисбаланс связан с мейоза сегрегация хромосомных перестроек (1), в том числе робертсоновских транслокации, реципрокных транслокаций, инверсий, и сложные перестановки (2). Рыба также может быть использован для выбора эмбрионов женского пола в семьях с Х-сцепленным заболеванием, для которого нет мутации конкретного теста (3, 4). Более спорно, FISH была также использована для выявления спорадических анеуплоидии хромосомы для того, чтобы попытаться улучшить эффективность искусственного оплодотворения (5, 6), однако прогностическая ценность этого теста с использованием FSIH, вероятно, будет неприемлемо низкой в большинстве людей руки и не рекомендуется для рутинного клинического использования (7). Эта статья посвящена техническим аспектам и ограничения FISH применяется для клинических одноклеточных диагноз.
Методы распространения и закрепления одного бластомеров включают метанол / уксусная кислота (5, 8), твин / HCl (9), и сочетание Tween / HCl и метанол / уксусная кислота (10). Изменения включают гипотоническая обработка клеток до распространения и / или пепсина и параформальдегида лечение после фиксации. Метод должен быть надлежащим образом проверены для лаборатории (14). Твин / HCl метод подробно описан в этой статье. Твин / HCl метод технически прост и в высшей степени воспроизводимы в разных лабораториях. Этот метод может быть использован для получения одного ядра для FISH диагностики определения пола и хромосомных перестроек с приемлемой диагностической точности (7).
Зонд смеси можно комбинировать прямо и косвенно помечены меченых зондов и зондов от разных производителей. Зонды для известных полиморфных участков хромосом (11, 12), или те, известный перекрестной гибридизации значительно с другими хромосомами (13) следует избегать, хотя может использоваться, если доказано, что конкретные и подходит для ПГД по предварительному тестированию как на репродуктивное партнеров . Доступные флуорохромами / гаптенов и стратегии для различения зонды включают следующее: Texas Red (TR), флуоресцеин изотиоцианат (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, биотинилированного зонда обнаружены с TR-авидин, FITC-авидин, или Су-5 стрептавидином (визуализируется использованием FarRed фильтр), сочетание красного и зеленого зонды для производства желтого сигнала, второй раунд гибридизации и третий цвет создана путем последовательного захвата SpectrumOrange использованием TexasRed и SpectrumGold фильтр).
Зонд множество, содержащее три зонды, специфичные для центромеры регионов X и Y хромосомы и аутосомы один, рекомендуется для определения пола (14), аутосомно-зонд используется для установления плоидности и тем самым провести различие между трисомии Х (2n, 47 , XXX) и триплоидии (3n, 69, XXX), а также между tetrasomy X (48, ХХХХ) и tetraploidy (4л, 92, ХХХХ). Типичный набор зонд применяется в этой ситуации является сочетание Abbott AneuVysion содержащих альфа-спутник X, Y, и 18; этот зонд набор был продемонстрирован имеют очень низкий уровень полиморфизма, и поэтому предварительная очистка рабочих из репродуктивного партнеров не требуется (14).
Зонд смесь для какой-либо конкретной перестройки должно: в идеале содержать зонды по крайней мере достаточно, чтобы обнаружить все ожидаемые продукты перестановки с хромосомными дисбаланс. Если это невозможно, зонд смесей, где незамеченными несбалансированной продукты были оценены как нежизнеспособное в узнаваемых беременности и, вероятно, имеют очень низкую распространенность может быть приемлемым (14). Быть проверено на культуре лимфоцитов метафаз с обеих репродуктивного партнеров. По крайней мере, десять метафазных должны быть проверены на предмет зонд специфичность, полиморфизмов и кросс-гибридизации, а для перевозчика перестройка хромосомы, чтобы гарантировать, что зонды гибридизации, как ожидается, различные сегменты перестановки. Кроме того, по меньшей мере 100 интерфазных ядрах из этих препаратов должен быть засчитан, оценить специфику сигнала, яркость и дискретности (14).
Commercial зонд PGS наборы доступны (например, Abbott MultiVysion РВ или ПГТ), ориентированных на хромосомах чаще оказываются в анеуплоидных продуктов зачатия, и в составе одного зонда на хромосому целенаправленными. Обычно ядро может иметь второй гибридизации с зондами для дополнительной хромосомы обеспечение для анализа хромосом 13, 15, 16, 18, 21, 22 и XY (14). Прогностическая ценность этого теста с использованием распространения и FISH методике, описанной здесь, вероятно, будет неприемлемо низкой в руки большинства людей, и она не рекомендуется для рутинного клинического использования (7, 15).
Такие методы, как сравнительный гибридизации генома (CGH) применительно к одной клетки способны, чтобы проверить на число копий каждой хромосомы (Wilton и соавт. 2001), и использование одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) массивы и количественный анализ (Уэллс и др. . 2008) или "karyomapping" генотипирования (Хэндисайда и соавт. 2009) являются перспективными альтернативных методов для обнаружения анеуплоидии хромосомы. Тем не менее, предел разрешающей способности и точности для сегмента дисбаланса остаются неопределенными, и вполне вероятно, что рыба будет оставаться методом выбора для хромосомных перестроек с участием небольших сегментов.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Hydrochloric Acid, 2.5L | VWR | 101254H | ||
Sodium Chloride, 5Kg | VWR | 443827W | ||
Potassium Chloride, 250g | VWR | 26764.232 | ||
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g | VWR | 102494C | ||
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g | VWR | 10203 4B | ||
Sodium Hydroxide Pellets, 500g | VWR | 28245.265 | ||
Tween20, 500mL | VWR | 663684B | ||
Ethanol, 2.5L | VWR | 8.18760.2500 | Duty Paid | |
Tri-Sodium Citrate, 5Kg | VWR | 27833.363 | ||
Cow Gum, 250mL | Cow Proofings Ltd. | No longer available | Old stocks can still be found in art shops | |
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul | Cytocell | DES500L | 150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe | |
Nail Varnish, 12mL | Boots | 10088316001 | ||
Amine-coated Slides, 25 | Genetix | K2615 | ||
DAPI, 0.1mL | Sigma-Aldrich | D-9542 | ||
Vectashield, 10mL | Vector Laboratories | H1000 | ||
Texas-Red-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2016 | ||
FITC-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2011 | ||
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL | GE Healthcare | PA45001 | ||
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500 | Thistle Scientific | AX-MCT-175-C | ||
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000 | Thistle Scientific | AX-MCT-060-C-CS | ||
30ml Universal Containers, box of 400 | Sterilin | 128B | Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053 | |
Hot Block | ||||
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick |
VWR VWR VWR |
451-0107 451-3112 451-3111 |
||
Plugged Glass Pipettes | Fisher Scientific | PMK-300-052R | ||
Dissecting Microscope | Wild Heerbrugg | |||
Tissues, 100boxes | NHS SUPPLY CHAIN | MJT058 | ||
Metal Culture Trays | ||||
Plastic Melamine Trays | VWR | 682-009 | ||
Oven | ||||
Mouth Pipette Mouthpiece | Scientific Laboratory Supplies | HAE3700 | ||
Tubing | ||||
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter | Fisher Scientific | FDM-340-010U | ||
Diamond Pen | VWR | 818-0021 | ||
Hot Block for Slides | Thermo Hybaid | HBOSBB | ||
Hybridization Chamber | ||||
Tissue Roll | NHS SUPPLY CHAIN | MJT004 | ||
Schieferdecker Jar | VWR | 631-9313 | ||
Coplin Jar | VWR | 631-9331 | ||
Forceps, Fine | VWR | 232-2123 | ||
Forceps, Blunt | VWR | 232-2113 | ||
1000mL Beaker | VWR | 213-1642 | ||
Phase Contrast Microscope | Nikon | E200 | ||
Fibre-free Blotting Cards, box of 100 | Fisher Scientific (Raymond Lamb) | SDE1 | ||
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3022 | ||
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3110 | ||
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3104 | ||
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3206 | ||
1mL Syringe, box of 100 | NHS Supply Chain | FWC045 | ||
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000 | Thistle Scientific | AX-T-1000-C-L-R | ||
Incubator | LEEC | |||
Waterbath | Grant | W22 | ||
Alcohol Thermometer | Various sources available | |||
pH Meter | Jenway | 3305 | ||
pH Electrode | VWR | 662-1759 | BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305 | |
Heated Stirrer | Bibby | HC502 | ||
1mL Pasteur Pipettes, box of 500 | Scientific Laboratory Supplies | PIP4202 | ||
Parafilm, 50mm x 75m | VWR | 291-1214 |