Dieser Artikel beschreibt die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf Präimplantations-Diagnostik (PGD) in einer klinischen Umgebung.
Pre-Präimplantationsdiagnostik (PID) ist eine etablierte Alternative zu den pränatalen Diagnostik, und beinhaltet die Auswahl vor der Implantation Embryonen aus einer Kohorte von assistierten Reproduktion (ART) generiert. Diese Auswahl kann aufgrund der familiären monogenen Erkrankungen (zB Mukoviszidose) erforderlich sein, oder weil ein Partner trägt ein Chromosom Umlagerung (zB ein Zwei-Wege-reziproken Translokation). Die PID ist für Paare, die bisherigen betroffenen Kinder gehabt haben, und / oder im Falle von Chromosomenveränderungen, wiederholte Fehlgeburten oder Unfruchtbarkeit zur Verfügung. Eizellen abgesaugt folgenden Stimulation der Eierstöcke durch in vitro Eintauchen in Samen (IVF) oder durch intrazytoplasmatische Injektion eines einzelnen Spermiums (ICSI) befruchtet werden. Pre-Implantation Spaltung-Embryonen sind biopsiert, in der Regel durch die Entnahme einer einzelnen Zelle an Tag 3 nach der Befruchtung, und die Biopsie Zelle wird getestet, um den genetischen Status des Embryos zu etablieren. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) auf der festen Kerne biopsiert Zellen mit target-spezifischen DNA-Sonden ist die Technik der Wahl auf Chromosom Ungleichgewicht mit Chromosomenumlagerungen assoziiert zu erkennen und weiblichen Embryonen in Familien wählen mit X-linked Krankheit, für die es keine Mutation-spezifischen Test. FISH wurde auch auf dem Bildschirm Embryonen für spontane Chromosom Aneuploidie (auch als PGS oder PGD-AS genannt) verwendet worden, um zu versuchen und verbessern die Effizienz der assistierten Reproduktion, aber die beschriebenen prädiktiven Wert dieses Tests unter Verwendung der Streu-und FISH-Technik hier ist wahrscheinlich unannehmbar niedrig bei den meisten Menschen die Hände und es ist nicht für die routinemäßige klinische Anwendung empfohlen. Wir beschreiben die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf die PID in einem klinischen Umfeld.
Die Anwendung von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) zu einem einzigen Embryo Zellen (Blastomeren) stellt besondere Herausforderungen sowohl in praktischen und in der Interpretation des Signals Muster. Die Biopsie Zelle benötigt, um innerhalb einer vorher definierten Bereich auf dem Objektträger ausgestrichen werden, um seine Lokalisation folgenden FISH erleichtern; extreme Pflege braucht, um sicherzustellen, dass die Zelle lysiert ist, dass das Zytoplasma wurde verteilt eingenommen werden, und dass der Kern sichtbar ist und intakt, und wie sich die Diagnose auf die Ergebnisse dieser einzelnen Zelle, strengsten Scoring und Leitlinien für die Auslegung angewandt werden sollte, hängt. Doch in erfahrenen Händen, ist FISH eine robuste Technik für Präimplantations-Diagnostik (PGD) in der klinischen Praxis. Das Prinzip der PGD von FISH ist, dass target-spezifischen DNA-Sonden mit verschiedenen Fluorochromen oder Haptenen markierte verwendet werden, um die Kopienzahl der spezifischen Loci zu erfassen, und damit auf Chromosom Ungleichgewicht mit meiotischen Segregation der Chromosomen-Rearrangements (1) verbunden sind, einschließlich Robertson'sche erkennen Translokationen, reziproke Translokationen, Inversionen und komplexen Rearrangements (2). Fische können auch verwendet werden, um weibliche Embryonen in Familien mit X-linked Krankheit wählen, für die es keine Mutation-spezifischen Test (3, 4). Umstrittener ist FISH auch Bildschirm für sporadische Chromosom Aneuploidie benutzt worden, um zu versuchen und verbessern die Effizienz der assistierten Reproduktion (5, 6), jedoch ist der prädiktive Wert der diesen Test mit FSIH wahrscheinlich unannehmbar niedrig bei den meisten Menschen ist Hände und es ist nicht für den klinischen Routineeinsatz (7) empfohlen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die technischen Aspekte und die Grenzen der FISH, die für klinische Single-Cell-Diagnose.
Methoden der Verbreitung und Befestigung einzelnen Blastomeren sind Methanol / Essigsäure (5, 8), Tween / HCl (9), und eine Kombination von Tween / HCl und Methanol / Essigsäure (10). Variationen sind hypotone Behandlung der Zellen vor der Verbreitung und / oder Pepsin und Paraformaldehyd-Behandlung nach der Fixierung. Die Methode sollte entsprechend für das Labor (14) validiert werden. Die Tween / HCl-Methode wird ausführlich in diesem Artikel beschrieben. Die Tween / HCl-Methode ist technisch einfach und hoch reproduzierbare in verschiedenen Labors. Diese Methode kann verwendet werden, um einzelne Kerne für die FISH-Diagnostik der Geschlechtsbestimmung und Chromosomenveränderungen mit akzeptablen diagnostische Genauigkeit (7) vorzubereiten.
Probe mischt kombinieren können direkt markiert und indirekt markierten Sonden und Sonden verschiedener Hersteller. Sonden für bekannte polymorphe Chromosom Regionen (11, 12), oder solche, die bekanntlich auch signifikant cross-Hybridisierung mit anderen Chromosomen (13) sollte vermieden werden, obwohl kann verwendet werden, wenn nachgewiesen werden spezifische und für PGD nach vorheriger Prüfung auf beiden reproduktiven Partner werden . Erhältlich Fluorochrome / Haptene und Strategien für anspruchsvolle Sonden gehören die folgenden: Texas Red (TR), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, biotinylierten Sonden mit TR-Avidin nachgewiesen, FITC-Avidin oder Cy-5 Streptavidin (visualisiert mit Hilfe eines FarRed Filter), eine Mischung aus Rot und Grün Sonden an ein gelbes Signal, eine zweite Runde der Hybridisierung und eine dritte Farbe, die durch sequentielle Erfassung von SpectrumOrange mit einem TexasRed und SpectrumGold Filter) erstellt produzieren.
Eine Sonde Set mit drei Sonden, die spezifisch für das Zentromer Regionen der X-und Y-Chromosomen und ein Autosom, ist für die Geschlechtsbestimmung (14) empfohlen, die autosomal-Sonde wird verwendet, um Ploidie und damit zu etablieren, um zwischen Trisomie X unterscheiden (2n, 47 , XXX) und Triploidie (3n, 69, XXX), und zwischen Tetrasomie X (48, XXXX) und Tetraploidie (4n, 92, XXXX). Ein typisches Sonde gesetzt angewendet in dieser Einstellung ist der Abbott AneuVysion Mix mit alpha-Satelliten-X, Y, und 18; dieser Sonde gesetzt wurde gezeigt, dass eine sehr niedrige Rate Polymorphismus haben und daher vor der Behandlung Aufarbeitung des reproduktiven Partner ist nicht erforderlich (14).
Die Sonde Mix für jede spezifische Umlagerung sollte: Idealerweise enthalten Sonden mindestens ausreichen, um all die erwarteten Produkte der Umlagerung mit Chromosom Ungleichgewicht zu erkennen. Wenn dies nicht möglich ist, mischt Sonde, wo die unentdeckt unsymmetrische Produkte bewertet wurden als nicht lebensfähig in einer erkennbaren Schwangerschaft und werden wahrscheinlich haben eine sehr niedrige Prävalenz akzeptabel sein kann (14). An kultivierten Lymphozyten Metaphasen sowohl reproduktive Partnern getestet werden. Mindestens zehn Metaphase Spreads sollten Sonde Spezifität, Polymorphismen und Kreuz-Hybridisierung untersucht werden, und für das Chromosom Umlagerung Träger, um sicherzustellen, dass die Sonden über die verschiedenen Segmente der Umlagerung erwartet hybridisieren. Darüber hinaus sollten mindestens 100 Interphasekernen von diesen Präparaten erzielt, um zu signalisieren Spezifität, Helligkeit und Diskretion (14) zu beurteilen.
Commercial PGS Sonde Sets sind verfügbar (zB Abbott MultiVysion PB oder PGT), Targeting die Chromosomen am häufigsten gefunden, in Produkte der Empfängnis aneuploid werden, und aus einem einzigen Sonde pro Chromosom ausgerichtet. In der Regel den Kern kann eine zweite Hybridisierung mit Sonden für zusätzliche Chromosomen Bereitstellung eines Assays für die Chromosomen 13, 15, 16, 18, 21, 22 und XY (14). Der prädiktive Wert des Tests mit der Streu-und FISH-Technik hier beschriebene ist wahrscheinlich unannehmbar niedrig bei den meisten Menschen die Hände und es ist nicht für den klinischen Routineeinsatz (7, 15) empfohlen.
Techniken wie komparative genomische Hybridisierung (CGH), die auf einzelne Zellen sind in der Lage, für die Kopienzahl von jedem Chromosom-Test (Wilton et al. 2001), und die Verwendung von Single Nucleotide Polymorphismen (SNP)-Arrays und quantitative Analyse (Wells et al . 2008) oder "karyomapping" Genotypisierung (Handyside et al. 2009) sind vielversprechende alternative Techniken auf Chromosom Aneuploidie zu erkennen. Allerdings bleiben die Auflösungsgrenze und Genauigkeit für das Segment Ungleichgewicht unsicher und es ist wahrscheinlich, dass FISH wird weiterhin die Methode der Wahl für Chromosomenveränderungen mit kleinen Segmenten werden.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Hydrochloric Acid, 2.5L | VWR | 101254H | ||
Sodium Chloride, 5Kg | VWR | 443827W | ||
Potassium Chloride, 250g | VWR | 26764.232 | ||
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g | VWR | 102494C | ||
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g | VWR | 10203 4B | ||
Sodium Hydroxide Pellets, 500g | VWR | 28245.265 | ||
Tween20, 500mL | VWR | 663684B | ||
Ethanol, 2.5L | VWR | 8.18760.2500 | Duty Paid | |
Tri-Sodium Citrate, 5Kg | VWR | 27833.363 | ||
Cow Gum, 250mL | Cow Proofings Ltd. | No longer available | Old stocks can still be found in art shops | |
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul | Cytocell | DES500L | 150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe | |
Nail Varnish, 12mL | Boots | 10088316001 | ||
Amine-coated Slides, 25 | Genetix | K2615 | ||
DAPI, 0.1mL | Sigma-Aldrich | D-9542 | ||
Vectashield, 10mL | Vector Laboratories | H1000 | ||
Texas-Red-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2016 | ||
FITC-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2011 | ||
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL | GE Healthcare | PA45001 | ||
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500 | Thistle Scientific | AX-MCT-175-C | ||
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000 | Thistle Scientific | AX-MCT-060-C-CS | ||
30ml Universal Containers, box of 400 | Sterilin | 128B | Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053 | |
Hot Block | ||||
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick |
VWR VWR VWR |
451-0107 451-3112 451-3111 |
||
Plugged Glass Pipettes | Fisher Scientific | PMK-300-052R | ||
Dissecting Microscope | Wild Heerbrugg | |||
Tissues, 100boxes | NHS SUPPLY CHAIN | MJT058 | ||
Metal Culture Trays | ||||
Plastic Melamine Trays | VWR | 682-009 | ||
Oven | ||||
Mouth Pipette Mouthpiece | Scientific Laboratory Supplies | HAE3700 | ||
Tubing | ||||
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter | Fisher Scientific | FDM-340-010U | ||
Diamond Pen | VWR | 818-0021 | ||
Hot Block for Slides | Thermo Hybaid | HBOSBB | ||
Hybridization Chamber | ||||
Tissue Roll | NHS SUPPLY CHAIN | MJT004 | ||
Schieferdecker Jar | VWR | 631-9313 | ||
Coplin Jar | VWR | 631-9331 | ||
Forceps, Fine | VWR | 232-2123 | ||
Forceps, Blunt | VWR | 232-2113 | ||
1000mL Beaker | VWR | 213-1642 | ||
Phase Contrast Microscope | Nikon | E200 | ||
Fibre-free Blotting Cards, box of 100 | Fisher Scientific (Raymond Lamb) | SDE1 | ||
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3022 | ||
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3110 | ||
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3104 | ||
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3206 | ||
1mL Syringe, box of 100 | NHS Supply Chain | FWC045 | ||
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000 | Thistle Scientific | AX-T-1000-C-L-R | ||
Incubator | LEEC | |||
Waterbath | Grant | W22 | ||
Alcohol Thermometer | Various sources available | |||
pH Meter | Jenway | 3305 | ||
pH Electrode | VWR | 662-1759 | BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305 | |
Heated Stirrer | Bibby | HC502 | ||
1mL Pasteur Pipettes, box of 500 | Scientific Laboratory Supplies | PIP4202 | ||
Parafilm, 50mm x 75m | VWR | 291-1214 |