Denna artikel beskriver valet av lämpliga givare för encelliga FISK, sprida tekniker för blastomere kärnor, och in situ hybridisering och signal poäng, gäller för preimplantatorisk genetisk diagnostik (PGD) i en klinisk miljö.
Preimplantatorisk genetisk diagnostik (PGD) är ett etablerat alternativ till fosterdiagnostik, och innebär att välja pre-implantation embryon från en kohort som genereras av assisterad befruktning teknik (ART). Detta urval kan krävas på grund av familjär monogena sjukdomar (t.ex. cystisk fibros), eller för att en partner bär på en kromosom ombildning (t ex en två-vägs ömsesidiga translokation). PGD är tillgänglig för par som tidigare har påverkat barnen, och / eller i händelse av kromosom omdisponeringar, upprepade missfall eller infertilitet. Oocyter aspirerat efter ovulationsstimulering befruktas av in vitro-nedsänkning i sperma (IVF) eller intracytoplasmatisk injektion av en enskild spermie (ICSI). Preimplantatorisk klyvning steg embryon biopsier, vanligen genom att ta bort en enda cell på dag 3 efter befruktning, och biopsier cellen testas för att fastställa den genetiska statusen av embryot. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) på den fasta kärnan av biopsier celler med mål-specifika DNA-prober är den teknik val för att upptäcka kromosom obalans i samband med kromosom omorganiseringar, och att välja kvinnliga embryon i familjer med X-bunden sjukdom som det inte finns ingen mutation-specifika test. FISK har också använts för att screena embryon för spontana kromosom aneuploidi (även känd som PGS och PGD-AS) i syfte att försöka förbättra effektiviteten i assisterad befruktning, men beskrev det prediktiva värdet för denna test med att sprida och FISH tekniken här sannolikt är oacceptabelt låg i de flesta människors händer och det rekommenderas inte för rutinmässig klinisk användning. Vi beskriver valet av lämpliga givare för encelliga FISK, sprida tekniker för blastomere kärnor, och in situ hybridisering och signal poäng, gäller för PGD i en klinisk miljö.
Tillämpningen av fluorescens in situ hybridisering (FISH) till en enda embryo cell (blastomere) presenterar speciella utmaningar både i praktiska och i tolkningen av signalen mönster. Den biopsier cellen måste spridas inom en på förhand definierat område i bilden, för att underlätta dess lokalisering följande fiskarter; extrem försiktighet måste vidtas för att säkerställa att cellen är lyserade, att cytoplasman har skingrats, och att kärnan är synlig och intakt, och som diagnosen beror på resultaten från denna enda cell, stränga poängsättning och tolkning riktlinjer bör tillämpas. Men i erfarna händer, är FISH en robust teknik för preimplantatorisk genetisk diagnostik (PGD) i klinisk praxis. Principen om PGD av fisk är att mål-specifika DNA-prober märkta med olika fluorokromer eller haptener kan användas för att detektera kopian antal specifika loci, och på så sätt att upptäcka kromosom obalans i samband med meiotiska segregering av kromosom omdisponeringar (1), inklusive Robertsonian translokationer, ömsesidiga translokationer, inversioner och komplexa omflyttningar (2). Fisk kan också användas för att välja kvinnliga embryon i familjer med X-bunden sjukdom för vilken det inte finns någon mutation-specifika tester (3, 4). Mer kontroversiellt är FISH också använts för att screena för sporadiska kromosom aneuploidi för att försöka förbättra effektiviteten i assisterad befruktning (5, 6), men det är det prediktiva värdet av detta test med hjälp av FSIH sannolikt oacceptabelt låg i de flesta människors händer och det rekommenderas inte för rutinmässig klinisk användning (7). Denna artikel koncentrerar sig på tekniska aspekter och de begränsningar som FISH tillämpas på klinisk encelliga diagnos.
Metoder för spridning och fastställande enda blastomerer innehålla metanol / ättiksyra (5, 8), Tween / HCl (9), och en kombination av Tween / HCl och metanol / ättiksyra (10). Variationer inkluderar hypoton behandling av cellerna innan de sprider sig och / eller pepsin och paraformaldehyd behandling efter fixering. Metoden bör vara lämpligt valideras för laboratoriet (14). Interpoleringen / HCl-metoden beskrivs i detalj i denna artikel. Interpoleringen / HCl-metoden är tekniskt enkel och mycket reproducerbar i olika laboratorier. Denna metod kan användas för att förbereda enstaka kärnor för FISH diagnostik av könsbestämning och omorganiseringar kromosom med acceptabla diagnostiska noggrannheten (7).
Probe mixar kan kombinera direkt märkta och indirekt märkta prober, och sonder från olika tillverkare. Sonder för kända polymorfa kromosomområden (11, 12), eller de kända för att över hybridisera signifikant med andra kromosomer (13) bör undvikas, men kan användas om visat sig vara specifik och lämplig för PGD av tidigare tester på både reproduktiv partner . Finns fluorokromer / haptener och strategier för att diskriminera sonder innehålla följande: Texas Red (TR), fluorescein (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, biotinylerad sonder upptäckas med TR-avidin, FITC-avidin, eller Cy-5 streptavidin (visualiseras med en FarRed filter), en blandning av rött och grönt sonder för att producera en gul signal, en andra omgång av hybridisering och en tredje färg som skapats av sekventiell fånga SpectrumOrange med hjälp av en TexasRed och en SpectrumGold filter).
En sond som innehåller tre prober, specifikt för centromer regioner i X-och Y-kromosomer och en autosome, rekommenderas för könsbestämning (14), den autosomal sonden används för att upprätta ploidi och därmed att skilja mellan trisomi X (2n, 47 , XXX) och triploidy 3n (, 69, XXX) och mellan tetrasomy X 48 (, XXXX) och tetraploidy 4N (, 92, XXXX). En typisk sond som tillämpas i denna inställning är Abbott AneuVysion blandning som innehåller alfa-satellit-X, Y och 18, denna givare som har visat sig ha en mycket låg polymorfism takt, och därför förbehandling upparbetning av reproduktiv partner krävs inte (14).
Sonden blandning för någon speciell ombildning bör helst innehålla sonder åtminstone tillräckligt för att upptäcka alla förväntade produkter av ombildning med kromosom obalans. Om detta inte är möjligt, blandar sond där oupptäckt obalanserade produkter har bedömts vara icke livskraftiga i en igenkännbar graviditet och har sannolikt mycket låg förekomst kan vara acceptabelt (14). Testas på odlade lymfocyter metafaser från båda reproduktiva partner. Minst tio metafas sprider bör undersökas för givare specificitet, polymorfismer och cross-hybridisering, och för kromosom ombildning bärare, för att säkerställa att sonder hybridisera som väntat till olika segment av ombildning. Dessutom bör minst 100 interfas kärnor från dessa förberedelser görs för att bedöma signal specificitet, ljusstyrka och discreteness (14).
Commercial PGS sond uppsättningar finns tillgängliga (t.ex. Abbott MultiVysion PB eller PGT), med inriktning på kromosomerna som oftast visar sig vara aneuploid i produkter av befruktningen, och som består av en ensam sond per kromosom riktade. Typiskt kärnan kan ha en andra hybridisering med sonder för extra kromosomer ger en assay för kromosomerna 13, 15, 16, 18, 21, 22, och XY (14). Det prediktiva värdet för denna test med att sprida och FISH teknik som beskrivs här är sannolikt att oacceptabelt låga i de flesta människors händer och det rekommenderas inte för rutinmässig klinisk användning (7, 15).
Tekniker såsom jämförande genomik hybridisering (CGH) tillämpas på enstaka celler kan testa för det antal kopior av varje kromosom (Wilton et al. 2001), och användning av single nucleotide polymorphisms (SNP) arrayer och kvantitativ analys (Wells et al . 2008) eller "karyomapping" genotypning (Handyside et al. 2009) är lovande alternativa tekniker för att upptäcka kromosom aneuploidi. Men upplösningen gränsen och noggrannhet för segmentet obalans fortfarande osäkra och det är troligt att fisk kommer att fortsätta vara den teknik val för kromosom omdisponeringar omfattar små segment.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Hydrochloric Acid, 2.5L | VWR | 101254H | ||
Sodium Chloride, 5Kg | VWR | 443827W | ||
Potassium Chloride, 250g | VWR | 26764.232 | ||
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g | VWR | 102494C | ||
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g | VWR | 10203 4B | ||
Sodium Hydroxide Pellets, 500g | VWR | 28245.265 | ||
Tween20, 500mL | VWR | 663684B | ||
Ethanol, 2.5L | VWR | 8.18760.2500 | Duty Paid | |
Tri-Sodium Citrate, 5Kg | VWR | 27833.363 | ||
Cow Gum, 250mL | Cow Proofings Ltd. | No longer available | Old stocks can still be found in art shops | |
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul | Cytocell | DES500L | 150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe | |
Nail Varnish, 12mL | Boots | 10088316001 | ||
Amine-coated Slides, 25 | Genetix | K2615 | ||
DAPI, 0.1mL | Sigma-Aldrich | D-9542 | ||
Vectashield, 10mL | Vector Laboratories | H1000 | ||
Texas-Red-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2016 | ||
FITC-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2011 | ||
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL | GE Healthcare | PA45001 | ||
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500 | Thistle Scientific | AX-MCT-175-C | ||
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000 | Thistle Scientific | AX-MCT-060-C-CS | ||
30ml Universal Containers, box of 400 | Sterilin | 128B | Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053 | |
Hot Block | ||||
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick |
VWR VWR VWR |
451-0107 451-3112 451-3111 |
||
Plugged Glass Pipettes | Fisher Scientific | PMK-300-052R | ||
Dissecting Microscope | Wild Heerbrugg | |||
Tissues, 100boxes | NHS SUPPLY CHAIN | MJT058 | ||
Metal Culture Trays | ||||
Plastic Melamine Trays | VWR | 682-009 | ||
Oven | ||||
Mouth Pipette Mouthpiece | Scientific Laboratory Supplies | HAE3700 | ||
Tubing | ||||
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter | Fisher Scientific | FDM-340-010U | ||
Diamond Pen | VWR | 818-0021 | ||
Hot Block for Slides | Thermo Hybaid | HBOSBB | ||
Hybridization Chamber | ||||
Tissue Roll | NHS SUPPLY CHAIN | MJT004 | ||
Schieferdecker Jar | VWR | 631-9313 | ||
Coplin Jar | VWR | 631-9331 | ||
Forceps, Fine | VWR | 232-2123 | ||
Forceps, Blunt | VWR | 232-2113 | ||
1000mL Beaker | VWR | 213-1642 | ||
Phase Contrast Microscope | Nikon | E200 | ||
Fibre-free Blotting Cards, box of 100 | Fisher Scientific (Raymond Lamb) | SDE1 | ||
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3022 | ||
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3110 | ||
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3104 | ||
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3206 | ||
1mL Syringe, box of 100 | NHS Supply Chain | FWC045 | ||
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000 | Thistle Scientific | AX-T-1000-C-L-R | ||
Incubator | LEEC | |||
Waterbath | Grant | W22 | ||
Alcohol Thermometer | Various sources available | |||
pH Meter | Jenway | 3305 | ||
pH Electrode | VWR | 662-1759 | BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305 | |
Heated Stirrer | Bibby | HC502 | ||
1mL Pasteur Pipettes, box of 500 | Scientific Laboratory Supplies | PIP4202 | ||
Parafilm, 50mm x 75m | VWR | 291-1214 |