Summary
为了评估
Abstract
在体内治疗肌肉疾病1,2,3的治疗干预的影响评估,定量分析方法,测量力的产生和治疗肌肉疲劳性。我们描述了一个新鲜explanted从小鼠后肢肌肉中的肌机械性能评估的详细方法。我们描述了小鼠趾长伸肌肌肉的非创伤性的收获,安装的肌肉,在肌肉地带肌动描记器(型号820MS;丹麦MYO技术)和最大抽搐,强直张力,收缩时间,半弛豫时间的测量,使用方波脉冲刺激器(型号S48;草技术)。使用这些测量,我们展示了具体的抽搐和规范化肌肉的横截面积,抽搐,强直紧张的比例,力-频率关系曲线和低频疲劳曲线 4强直张力的计算。这种分析方法提供了一个为1,2,3,5肌肉疾病的小鼠模型,以及治疗干预的肌肉功能的基因改造6,7,8,9影响比较之间的定量比较。
Protocol
加州大学旧金山分校的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准该协议。
1。鼠标趾长伸肌 (EDL)肌肉的解剖
- 按照机构准则执行的所有动物的程序。
- 安乐死与200 mg / kg腹腔巴比妥/颈椎脱位,肌肉收获10前的动物。剥离应实行,使肌肉可收获和“安乐死”的15分钟内,安装在张力换能器。
- 夹层纸盒和引脚腿到托盘上排列胴体仰卧。
- 在解剖镜下,开放的皮肤,小心地打开筋膜(图1a),和剥离胫骨从脚踝向上暴露的EDL(图1b) 。使用滴乳酸林格氏液,以保持肌肉湿润和收获期间的缓冲。
- 删除的EDL,保留尽可能多的肌腱上,每年年底,并把到一个Petri菜含有乳酸林格氏液。铁缝合肌腱( 图1c)。重要的是,肌纤维不能触及,或在清扫不安。
2。鼠标EDL的安装在肌肉地带肌动描记
- 对于这些研究中,一个组织洗澡是需要的,固定的肌肉,同时允许它在恒温沐浴在生理溶液中连续充氧。洗澡加上一个力传感器的测量肌肉紧张。我们采用从丹麦MYO技术(DMT型号820MS)的综合肌肉地带肌动描记洗澡为此。此外,一个方形脉冲电刺激(草型号S48)和数据采集平台(ADInstruments PowerLab系统的数据采集系统和LabChart软件)引出,记录和分析MYO机械的反应,分别需要。大唐820MS集成到盒盖定位肌肉两侧肌肉地带中旬部分,铂电极。其他myographs可能需要特别注意电极放置。
- 肌动描记浴填写5毫升克雷布斯Henseleit解决方案11。加热至25 ° C。泡泡O 2 / CO 2(95%/ 5%),通过洗澡前15分钟使用。
- 使用缝线的EDL肌动描记夹具之间的延长和夹具之间的EDL肌筋(Fig.1D五 )安全。要小心不要夹肌肉本身。
- 肌动描记浴保持在25 ° C。
3。肌的力学分析
A.抽搐紧张
- 在洗澡时设置的初始长度,以便有没有肌肉松弛。
- 确定通过调整电压,以获得最大的抽搐紧张的最大刺激(持续时间为0.5毫秒),然后设定在20%以上最大的刺激(实现超最大刺激)。在我们的研究,超最大的刺激,通常在40伏的输出实现。
- 验证从使用示波器的刺激输出。
- 确定最佳长度逐渐伸展的肌肉,直到没有抽搐的紧张局势进一步增加。
- 允许3分钟的肌肉平衡。
- 交付平方米超最大的刺激在最佳使用电子刺激S44草的长度(0.5毫秒),并记录输出。
- 记录:抽搐张力曲线(P T随时间; 图2A)。
B.破伤风紧张
- 让肌肉休息3分钟。
- 应用最佳使用电子刺激S44草的长度在150赫兹的超最大刺激的列车为300毫秒,并记录输出。
- 记录:破伤风张力曲线(P O随时间; 图2B)。
C.部队频率
- 让肌肉休息3分钟。
- 部队频率:适用于30,60,100,140和160赫兹的超最大刺激的列车,彼此之间的刺激(图3)休息3分钟。此外,火车可应用于15,25,35,45,55,65,75,100,140和160赫兹在较低的频率更高的分辨率,其中力变化显着。
- 剧情:力频率的关系(%最大力量与刺激频率)。
D.疲劳
- 应用短破伤风的火车:300毫秒(或调整,以产生50%的峰值力的频率),每10分钟3秒60赫兹。 10分钟,强直力下降的一个〜15%的初始值( 图4)高原水平。
- 剧情:低频疲劳(%最大力量与时间)。
E.在协议结束额外的数据收集
- 在卸载肌肉的肌动描记之前,设置MUSC乐在最佳长度确定的步骤III.A.4,使用显微镜或一个眼,用游标卡尺测量其直径。计算截面积(2微米)。
- 通过去除缝线,体重肌肉测量肌肉质量(毫克)。
- 称重鼠标评估体重(GM)。
4。计算
- 肌肉:体重比=
肌肉质量/体质量 - 抽搐紧张,P T(MN)=
在抽搐产生的最大张力 - 具体抽搐张力(N /厘米2)=
抽搐张力(MN)/截面积(2微米)× 10 5 / MN•微米2 /厘米2 - 到峰值张力时间(毫秒)=
从收缩发病时间最大张力 - 半弛豫时间(毫秒)=
从峰值紧张到峰值张力的50% - 强直紧张,P O(MN)=
在破伤风产生的最大张力 - 具体强直张力(N /厘米2)=
强直张力(MN)/截面积(2微米)× 10 5 / MN•微米2 /厘米2 - 破伤风上升最大速率(N / S)=
期间,破伤风,即紧张,强直张力曲线的最大斜率(或DP的O / DT)上升的紧张局势加剧的最高税率 - 半松弛强直张力(MS)=
时间从停止刺激,在紧张刺激终止的50% - 抽搐紧张强直张力比,P - T / P O =
最大抽搐张力/最大强直张力 - 疲劳指数=
经过两分钟的低频疲劳等长张力最大的张力比
5。代表性的成果
图1。剖析的EDL肌肉。 EDL的一个 muscles.TA,后肢胫前,B,EDL(趾长伸肌)肌曝光,曝光C,EDL的肌腱缝合的附件,D,张力传感器浴(从侧面看),E,安装在洗澡(从上面)。在肌肉未完全沉浸在缓冲区,仅供;在实践中,应完全沉浸肌肉,防止干燥。
图2。张力曲线的例子 。 的抽搐紧张说明抽搐最大张力(P T),收缩时间(CT)和半弛豫时间(HRT)的曲线,例如酒吧,1秒,B,强直张力曲线显示最大强直张力(P O)的例子,半松弛强直张力(HRTT)。酒吧,1S。
图3。力频率的关系分析的例子 。 ,增量刺激频率产生的紧张局势,B,例如,在30MHz的脉冲序列。酒吧,80毫秒,C,例如,在140MHz的脉冲序列。酒吧,80毫秒,D,从A 中显示的数据派生的力-频率曲线的例子。力 - 频率曲线的形状是肌肉力量的特点,可以比较来自不同动物的肌肉之间。
图4。低频疲劳分析的例子 。超过stimulation.Examples在指定的时间点(B,C,D)的低频脉冲串期间产生了递减的紧张局势图所示,E,从 A中显示的数据产生的低频疲劳曲线的范例。低频疲劳曲线的形状是肌肉力量的特点,可以比较来自不同动物的肌肉之间。
Discussion
我们描述了一个详细的评估,在explanted从小鼠后肢肌肉的肌机械性能的方法。 EDL的,而更难以解剖,因为其背后的胫前肌后的位置,比胫前,因为其突出的腱附件的脚踝和膝盖关节更容易评估。这些筋便于安装在肌肉地带肌动描记。相反,更容易访问的胫前在膝关节广泛,几乎atendinous附件,异常艰难的两个剖析不影响肌肉的前提下,并安装在肌动描记安全。我们还指出,迅速安装在生理缓冲液和温度中的含氧浴肌肉,保持肌肉的力学性能是必不可少的。我们发现,我们可以长达30分钟重复这种分析没有显着变化,在这种条件下肌肉反应。最后,它是必不可少的,肌纤维不被感动在解剖和安装程序,可以有肌肉功能上的不利影响,并导致低估肌机械力。遵循这些程序,这种分析提供了可靠的定量方法来评估的肌肉功能的基因改造6,7,8,9影响,以及在肌肉疾病的小鼠模型1,2,3,5治疗性干预之间的比较。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持公共卫生服务津贴(HL086513)从NHLBI私立教育机构,以及来自加州再生医学(RC1 - 00104),公共卫生服务津贴(HL085377)从NHLBI研究所的综合研究资助和礼品波林基金会HSB
资深大律师是一个加州再生医学的桥梁研究所的支持干细胞研究奖(TB1 - 01194)旧金山州立大学。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
5-0 silk sutures | Oasis | MV682 | General surgery |
Dupont #5 forceps | WPI | 500233 | General surgery |
Hemostat, straight | WPI | 501241 | General surgery |
Iris forceps | WPI | 15914 | General surgery |
Lab Chart software | ADInstruments | Version 7 | Data analysis |
Muscle Strip Myograph | DMT | 820MS | Tension transduction |
Operating scissors | WPI | 501754 | General surgery |
Oscilloscope | EZ | OS-5020 | Tension stimulation |
Pentobarbital, sodium salt | Sigma | P3761 | Euthanasia |
PowerLab | ADInstruments | 8/30 | Data acquisition |
Square Pulse Stimulator | Grass Tech. | S48 | Tension stimulation |
Vannas spring scissors | WPI | 14003 | General surgery |
Solutions and Media |
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Lactated Ringer's solution |
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Krebs Henseleit solution |
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Pentobarbital |
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References
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