Summary
Для оценки
Abstract
Для оценки в естественных эффектов терапевтических вмешательств для лечения мышечных заболеваний 1,2,3, количественные методы необходимы для измерения формирование сил и утомляемость в обработанных мышцы. Мы описываем детальный подход к оценке мио-механических свойств в только что эксплантированных мышцы задних конечностей мыши. Мы описываем атравматической урожай мыши разгибателей мышц пальцев Лонга, монтаж мышцы в мышцу полосы myograph (модель 820MS; датской технологии Мио), и измерения максимальной дергаться и тетаническое напряженности, сокращение времени, и половину времени релаксации, используя прямоугольного импульса стимулятора (модель S48; Трава технологий). С помощью этих измерений, мы демонстрируем расчета конкретных дергаться и тетаническое напряжение мышц нормированная на площадь поперечного сечения, дергаться до тетаническое соотношение напряжения, силы частоты кривой отношения и низкой кривой усталости частоты 4. Этот анализ предоставляет метод для количественного сравнения терапевтических вмешательств на мышах мышечных заболеваний 1,2,3,5, а также сравнение эффектов генетической модификации на мышечную функцию 6,7,8,9.
Protocol
Протокола осуществляется с одобрения UCSF Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC).
1. Препарирование Мышь Экстензорных пальцев Лонга (ДЭС) мышц
- Выполнение всех животных процедур в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
- Усыпить животное с 200 мг / кг внутрибрюшинно пентобарбитал / шейки дислокации незадолго до мышц урожая 10. Рассечение должны быть отработаны так, что мышцы могут быть собраны и установлены в преобразователь напряжения в течение 15 минут эвтаназии.
- Упорядочить тушу на спине на лоток рассечение и пин-код ногу в трей.
- Под микроскопом вскрытия, открытый коже, осторожно откройте фасции (рис. 1а), а кожуру большеберцовой от лодыжки вверх, чтобы разоблачить EDL (рис.1б). Использование капель раствора лактата Рингера держать мышцы влажные и буфером во время сбора урожая.
- Удалить EDL, сохраняя столько сухожилия насколько возможно на каждом конце, и положить в чашку Петри с раствором лактата Рингера. Tie шва к каждому из мышц сухожилий (Fig.1C). Очень важно, чтобы мышечные волокна не коснулась или нарушения во время вскрытия.
2. Монтаж Мышь EDL в Myograph Газа мышц
- Для этих исследований тканей ванны необходимы, что обеспечивает мускула, что позволяет ему купаться в физиологическом растворе при постоянной температуре с непрерывной оксигенации. Ванна в сочетании с силой датчик для измерения напряжения мышц. У нас работают интегрированные мышц полосы myograph ванны из датских Мио технологий (DMT Модель 820MS) для этой цели. Кроме того, прямоугольные импульсы электрического стимулятора (Grass Модель S48) и сбора данных платформы (ADInstruments PowerLab Data System Приобретение и LabChart программное обеспечение), необходимые для выявления, учета и анализа мио-механические ответы, соответственно. 820MS DMT имеет платиновыми электродами интегрированы в крышку камеры, которые расположены по обе стороны от мышц, в средней части мышцы полосы. Другие myographs может потребовать особого внимания к электроду размещения.
- Заполните myograph ванну с 5 мл Кребса Хенселейта 11. Нагреть до 25 ° C. Bubble O 2 / CO 2 (95% / 5%) через ванну в течение 15 минут перед использованием.
- Используйте швы, чтобы продлить EDL между зажимами myograph и безопасной сухожилия EDL мышцы (Fig.1D, E) между зажимами. Будьте осторожны, чтобы не зажимать мышцы.
- Поддерживать myograph бане при 25 ° C.
3. Мио-механический анализ
А. Twitch напряженности
- Установить начальную длину в ванне, так что нет мышц расхлябанности.
- Определите максимальный стимул (длительностью 0,5 мс), регулируя напряжение с целью получения максимальной напряженности дергаться, то набор стимулов на 20% выше максимальной (для достижения supramaximal стимула). В наших исследованиях supramaximal стимул, как правило, достигается при выходе 40 вольт.
- Проверьте выход из стимулятор с помощью осциллографа.
- Определить оптимальную длину постепенно растяжение мышц, пока не будет дальнейшего увеличения дергаться напряженности.
- Разрешить мышцы, чтобы уравновесить в течение 3 мин.
- Доставить supramaximal квадратных стимула (0,5 мс) при оптимальной длине использованием Трава S44 электронного стимулятора, и записать вывод.
- Запись: дергаться напряженности кривой (Р и в зависимости от времени; рис. 2).
Б. Столбняк напряженности
- Разрешить мышц, чтобы отдохнуть в течение 3 минут.
- Применить поезд supramaximal стимулы для 300msec при 150 Гц при оптимальной длине использованием Трава S44 электронного стимулятора, и записать вывод.
- Запись: столбняка напряженности кривой (Р о зависимости от времени; рис.2б).
С. Силы частоты
- Разрешить мышц, чтобы отдохнуть в течение 3 минут.
- Силы частота: применять поездов supramaximal стимулов на 30, 60, 100, 140 и 160 Гц с 3 минут отдыха между стимулом (рис.3). Кроме того, поезда могут быть применены 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 и 160 Гц для лучшего разрешения на более низких частотах, где силы существенно изменяется.
- Сюжет: форс-частоты отношения (% максимальной силы против стимуляции частота).
Д. Усталость
- Применить последовательность коротких столбняка: 60 Гц в течение 300 мс (или частота регулируется для получения 50% от пиковой силы), каждые 3 секунды в течение 10 минут. К 10 минут, тетаническое сила должна отказаться от плато уровне ~ 15% от начального значения (рис.4).
- Участок: низкая утомляемость частоты (% максимальное время против силы).
Е. Дополнительные сбора данных в конце протокола
- Перед размонтирования мышцы от myograph, установить MUSCле при оптимальной длине, как это определено в пункте III.A.4 и измерить его диаметр с использованием либо глазных на микроскопом или с суппортами. Вычислить площадь поперечного сечения (мкм 2).
- Мера мышечную массу (мг) путем удаления швов и весом мышцы.
- Взвесьте мыши для оценки массы тела (г).
4. Расчеты
- Мышцы: отношение массы тела =
мышечная масса / масса тела - Twitch напряжение, Р Т (Мп) =
максимального напряжения, образующихся при дергаться - Конкретные напряженности дергаться (Н / см 2) =
дергаться напряжения (MN) / площадь поперечного сечения (мкм 2) х 10 5 Н / мН • мкм 2 / см 2 - Время до пика напряжения (мс) =
время от начала сокращения до максимального напряжения - Half-время релаксации (мс) =
время от пика напряжения до 50% от пикового напряжения - Тетаническое напряжение, Р О (тп) =
максимального напряжения, образующихся при столбняка - Конкретные тетаническое натяжения (Н / см 2) =
тетаническое натяжение (мН) / площадь поперечного сечения (мкм 2) х 10 5 Н / мН • мкм 2 / см 2 - Максимальная скорость нарастания столбняка (N / с) =
Максимальная скорость роста напряженности во время роста напряженности столбняка, т.е. максимального наклона кривой тетаническое напряжения (или, дР O / д) - Half-релаксации тетаническое напряжения (мс) =
время от прекращения стимуляции до 50% от напряжения на прекращение стимуляции - Twitch напряжение до тетаническое соотношение напряжения, P T / P = O
максимальное напряжение дергаться / максимальная напряженность тетаническое - Усталость индекс =
коэффициент напряженности через две минуты низкой усталостью частоту максимального изометрического напряжения
5. Представитель Результаты
Рисунок 1. Препарирование EDL мышцы. , Выдержки из задних конечностей muscles.TA, передней большеберцовой. B, выдержки из EDL (разгибателей пальцев Лонга) мышцы. C, Приложение швов на EDL сухожилия. D, напряжение преобразователя ванна (вид со стороны). Е, EDL установлен в ванной (вид сверху). Мышцы полностью погружен в буфер в иллюстративных целях, на практике, мышцы должны быть полностью погружены, чтобы предотвратить от высыхания.
Рисунок 2. Пример напряженности кривых. , Пример дергаться напряженности кривой иллюстрирующий максимальное напряжение дергаться (р т), сокращение времени (КТ) и половину времени релаксации (ЗГТ). Бар, 1 с. B, Пример тетаническое кривой напряжения показывает максимальное тетаническое напряжения (Р о) и половину релаксации тетаническое натяжения (HRTT). Бар, 1 с.
Рисунок 3. Пример форс-частоты отношения анализа. , Напряженность порожденных дополнительные частоты стимуляции. B, Пример импульсов на 30 МГц. Бар, 80 мс. C, Пример импульсов на 140 МГц. Бар, 80 мс. D, пример силы частоты кривая получена на основе данных показано на. Форма форс-частотной кривой характерна мышечная сила, и их можно сравнить между мышцами различных животных.
Рисунок 4. Пример анализа низких частот усталость. , Декрементные напряженностью свыше период низких stimulation.Examples частота импульсов в указанных точках времени (B, C, D), приведены ниже. E, пример низкой кривой усталости частоты на основе данных показано на. Форма кривой усталости низкие частоты характерна мышечная сила, и их можно сравнить между мышцами различных животных.
Discussion
Мы описываем детальный подход к оценке мио-механических свойств в эксплантированных мышцы задних конечностей мыши. EDL, а более трудно анализировать из-за его заднем положении позади передней большеберцовой мышцы, легче оценить, чем передней большеберцовой из-за его выдающийся сухожильных вложений в лодыжке и коленных суставов. Эти сухожилия облегчения монтажа в myograph полосу мышцы. В противоположность этому, более легкий доступ к передней большеберцовой имеет широкий, почти atendinous вложений в коленном суставе, что делает его исключительно трудной для обеих рассекают без ущерба для мышц, и смонтировать надежно myograph. Отметим также, что быстро монтажа мышц кислородом ванны в физиологическом буфере и температуры имеет важное значение для сохранения механических свойств мышц. Мы обнаружили, что мы можем повторить этот анализ на срок до 30 минут без существенных изменений в мышцах ответ в этих условиях. Наконец, очень важно, чтобы мышечные волокна не трогать во время вскрытия и монтажные процедуры, так как это может оказать неблагоприятное воздействие на мышечную функцию, и в результате недооценки мио-механической силы. Следуя этим процедурам, этот анализ предоставляет надежный количественный подход к оценке последствий генетической модификации на мышечную функцию 6,7,8,9, а также сравнение терапевтических вмешательств на мышах мышечных заболеваний 1,2,3,5 .
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Общественной службы здравоохранения Грант (HL086513) от NHLBI для ПЭО, и Всеобъемлющее Грант Исследования, проведенные в Калифорнийском Институте регенеративной медицины (RC1-00104), Службы общественного здравоохранения Грант (HL085377) от NHLBI, и подарок от Поллин Фонда HSB
SC был поддержан Калифорнийского института регенеративной медицины Мосты для Исследования стволовых клеток Award (ТВ1-01194) в San Francisco State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 silk sutures | Oasis | MV682 | General surgery |
| Dupont #5 forceps | WPI | 500233 | General surgery |
| Hemostat, straight | WPI | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | WPI | 15914 | General surgery |
| Lab Chart software | ADInstruments | Version 7 | Data analysis |
| Muscle Strip Myograph | DMT | 820MS | Tension transduction |
| Operating scissors | WPI | 501754 | General surgery |
| Oscilloscope | EZ | OS-5020 | Tension stimulation |
| Pentobarbital, sodium salt | Sigma | P3761 | Euthanasia |
| PowerLab | ADInstruments | 8/30 | Data acquisition |
| Square Pulse Stimulator | Grass Tech. | S48 | Tension stimulation |
| Vannas spring scissors | WPI | 14003 | General surgery |
Solutions and Media |
|||
Lactated Ringer's solution |
|||
|
|||
Krebs Henseleit solution |
|||
|
|||
Pentobarbital |
|||
|
|||
References
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
- Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
- Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
- MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
- Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
- Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
- Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
- Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
- Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , Forthcoming (2010).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
- Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).
