ميو الميكانيكية وتحليل الهيكل العظمي والعضلات المعزولة

Summary

لتقييم

Abstract

لتقييم آثار في الجسم الحي من التدخلات العلاجية لعلاج مرض في العضلات ^1،2،3 ، هناك حاجة إلى الأساليب الكمية لقياس توليد القوة وتعب في العضلات المعالجة. نحن تصف نهجا مفصلة لتقييم الخصائص الميكانيكية وميو في العضلات hindlimb explanted طازجة من الماوس. وصفنا الحصاد ارضحي من العضلات الطويلة الباسطة لأصابع الفأر ، تركيب عضلي في عضلة myograph الشريط (النموذجي 820MS ؛ الدنماركي ميو التكنولوجيا) ، وقياس نشل والتوتر القصوى كزازي ، تقلص الوقت ، والوقت نصف الاسترخاء ، وذلك باستخدام ساحة نبض منشط (النموذجي S48 ؛ تقنيات العشب). استخدام هذه القياسات ، وندلل على حساب نشل محددة والتوتر إلى المنطقة كزازي تطبيع مستعرضة العضلات ، ونشل إلى كزازي نسبة التوتر ، ومنحنى العلاقة قوة التردد والتعب منحنى التردد المنخفض ^4. هذا التحليل يوفر طريقة للمقارنة كمية بين التدخلات العلاجية في نماذج الماوس من مرض في العضلات ^1،2،3،5 ، وكذلك المقارنة بين آثار التعديل الوراثي على وظيفة العضلات ^6،7،8،9.

Protocol

يتم تنفيذ البروتوكول بموافقة الحيوان UCSF الرعاية المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC).

1. تشريح الفأر الطويلة الباسطة لأصابع (EDL) العضلات

1. تنفيذ كافة الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
2. الموت ببطء الحيوانية مع 200 ملغم / كغم من التفكك بنتوباربيتال / عنق الرحم داخل الصفاق قبيل الحصاد العضلات ^10. وينبغي أن يمارس تشريح جيدا بحيث يمكن حصاده العضلات وتصاعدت حدة التوتر في محول في غضون 15 دقيقة من القتل الرحيم.
3. ترتيب مستلق على علبة تشريح الجثة وساقه إلى علبة دبوس.
4. تحت المجهر الظنبوبي تشريح ، والجلد مفتوحة ، فتح اللفافة بعناية (Fig.1A) ، وقشور من الكاحل صعودا لفضح مؤسسة كهرباء لبنان (Fig.1B). استخدام قطرات من محلول رينغر lactated لإبقاء العضلات رطبة وتخزينها أثناء الحصاد.
5. إزالة مؤسسة كهرباء لبنان ، والحفاظ على أكبر قدر ممكن من وتر على كل نهاية ، ووضعها في طبق بتري تحتوي على حل لرينغر lactated. التعادل الدرز إلى كل من أوتار العضلات (Fig.1C). فمن الضروري أن ألياف العضلات لا يمكن لمسها أو تحريكها أثناء تشريح.

2. المتصاعدة من مؤسسة كهرباء لبنان ماوس في العضلات قطاع Myograph

1. لهذه الدراسات ، هناك حاجة إلى حمام الأنسجة التي تحفظ في العضلات في حين يسمح لها بالاستحمام في حل الفسيولوجية عند درجة حرارة ثابتة مع الأوكسجين المستمر. ويقترن الحمام مع محول قوة لقياس توتر العضلات. نحن نوظف مهبط العضلات متكاملة من حمام myograph الدنماركي ميو التكنولوجيا (DMT 820MS النموذجي) لهذا الغرض. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى محفز نبض مربع الكهربائية (النموذجي غراس S48) ، وبيانات حيازة منصة (ADInstruments الحصول على البيانات والبرمجيات PowerLab نظام LabChart) لانتزاع وتسجيل وتحليل ميو الميكانيكية والردود ، على التوالي. و820MS DMT أقطاب البلاتين ودمجها في الدائرة التي تغطي متوضعة على جانبي العضلات ، في منتصف الجزء من الشريط العضلات. قد myographs أخرى تتطلب اهتماما خاصا لوضع قطب كهربائي.
2. ملء حوض الاستحمام myograph مع 5 مل حل هنسلايت كريبس ^11. الحارة إلى 25 درجة مئوية. فقاعة O ₂ / CO ₂ (95 ٪ / 5 ٪) من خلال الاستحمام لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
3. استخدام الخيوط الجراحية لتوسيع مؤسسة كهرباء لبنان من بين المشابك myograph وتأمين أوتار العضلات مؤسسة كهرباء لبنان (Fig.1D ، E) بين المشابك. يجب الحرص على عدم كبح العضلات نفسها.
4. الحفاظ على حمام myograph عند 25 درجة مئوية.

3. ميو الميكانيكية والتحليل

ألف نشل التوتر

1. تعيين طول الأولي في الحمام حتى لا يكون هناك أي تهاون في العضلات.
2. تحديد الحوافز القصوى (مدة 0،5 مللي ثانية) من خلال تعديل الجهد من أجل الحصول على أقصى قدر من التوتر نشل ، ثم تعيين الحوافز بنسبة 20 ٪ فوق الحد الأقصى (لتحقيق التحفيز فوق الأعظمي). في دراساتنا ، وعادة ما يتحقق الحافز فوق الأعظمي في الانتاج من 40 فولت.
3. تحقق الإخراج من منشط باستخدام الذبذبات.
4. تحديد طول المثلى التي تمتد تدريجيا العضلات حتى لا تزيد من حدة التوتر في نشل.
5. السماح للتوازن العضلات لمدة 3 دقائق.
6. تقديم الحوافز مربع فوق الأعظمي (0.5 مللي ثانية) على طول الأمثل باستخدام منشط غراس S44 الإلكترونية ، وناتج قياسي.
7. السجل : التوتر نشل منحنى (ف الوقت مقابل _ر ؛ Fig.2A).

باء الكزاز التوتر

1. السماح لباقي العضلات لمدة 3 دقائق.
2. تطبيق القطار فوق الأعظمي من المحفزات ل300msec عند 150 هرتز على طول الأمثل باستخدام منشط غراس S44 الإلكترونية ، وناتج قياسي.
3. السجل : منحنى التوتر الكزاز (ف _س مقابل الوقت ؛ Fig.2B).

جيم قوة التردد

1. السماح لباقي العضلات لمدة 3 دقائق.
2. قوة التردد : تطبيق القطارات فوق الأعظمي من المحفزات في 30 ، 60 ، 100 ، 140 ، و 160 هرتز مع 3 دقائق راحة بين كل التحفيز (Fig.3). بدلا من ذلك ، قد يتم تطبيق القطارات 15 ، 25 ، 35 ، 45 ، 55 ، 65 ، 75 ، 100 140 ، و 160 هرتز لأفضل قرار في ترددات منخفضة نسبيا ، حيث التغيرات قوة كبيرة.
3. المؤامرة : قوة التردد العلاقة (٪ مقابل القوة القصوى التحفيز التردد).

دال التعب

1. تطبيق قطار الكزازية القصير : 60 هرتز لمدة 300 مللي ثانية (أو تردد تعديلها لإنتاج 50 ٪ من القوة الذروة) ، 3 ثوان كل 10 دقائق. قبل 10 دقائق ، وينبغي أن القوة كزازي انخفاض الى مستوى 15 ٪ من هضبة ~ من القيمة الأولية (Fig.4).
2. المؤامرة : انخفاض التعب تردد (٪ مقابل القوة القصوى الوقت).

هاء جمع بيانات إضافية في نهاية البروتوكول

1. قبل unmounting عضلة من myograph ، تعيين muscلو مطولا الأمثل كما هو محدد في الخطوة III.A.4 وقياس قطرها باستخدام إما بصري على المجهر أو مع الفرجار. حساب منطقة مستعرضة (ميكرون ^2).
2. قياس كتلة العضلات (ملغ) عن طريق إزالة الغرز وتزن العضلات.
3. وزن الماوس لتقييم كتلة الجسم (جم).

4. الحسابات

1. العضلات : كتلة الجسم نسبة =
   كتلة العضلات / كتلة الجسم
2. التوتر نشل ، ف _ر (MN) =
   أقصى التوتر المتولدة أثناء نشل
3. التوتر محددة نشل (N / سم ²⁾ =
   التوتر نشل (MN) / مساحة المقطع العرضي ⁽² ميكرون) × 10 ⁵ N / MN • ميكرومتر ² / سم ²
4. الوقت التوتر ذروته (مللي ثانية) =
   الوقت من بداية الانكماش في التوتر القصوى
5. نصف الوقت الاسترخاء (مللي ثانية) =
   الوقت من التوتر ذروته الى 50 ٪ من التوتر ذروته
6. كزازي التوتر ، P _O (MN) =
   أقصى التوتر المتولد خلال الكزاز
7. كزازي التوتر محددة (N / سم ²⁾ =
   كزازي التوتر (MN) / مساحة المقطع العرضي ⁽² ميكرون) × 10 ⁵ N / MN • ميكرومتر ² / سم ²
8. أقصى معدل ارتفاع الكزاز (N / ثانية) =
   أقصى معدل للزيادة في التوتر خلال ارتفاع حدة التوتر في الكزاز ، أي المنحدر من أقصى منحنى التوتر كزازي (أو موانئ دبي _O / DT)
9. نصف استرخاء التوتر كزازي (مللي ثانية) =
   الوقت من وقف التحفيز إلى 50 ٪ من التوتر في إنهاء التحفيز
10. نشل التوتر إلى كزازي نسبة التوتر ، ف _ر / P _O =
    أقصى التوتر نشل كزازي التوتر / الأقصى
11. مؤشر التعب =
    نسبة التوتر بعد دقيقتين من التعب التردد المنخفض إلى التوتر القصوى متساوي القياس

5. ممثل النتائج

الشكل 1. تشريح العضلات مؤسسة كهرباء لبنان. التعرض من muscles.TA hindlimb ، الظنبوبي الأمامي باء ، التعرض للعضلة (الباسطة للأصابع الطويلة) مؤسسة كهرباء لبنان. C ، مرفق من الغرز لمؤسسة كهرباء لبنان الأوتار دال ، التوتر محول حمام (وجهة نظر من الجانب). E ، شنت مؤسسة كهرباء لبنان في الحمام (وجهة نظر من أعلاه). منغمسين في العضلات بشكل غير كامل في المنطقة العازلة لأغراض توضيحية ، وفي الممارسة العملية ، ينبغي أن تكون مغمورة تماما في العضلات لمنع من الجفاف.

الشكل 2. مثال منحنيات التوتر. وعلى سبيل المثال ، من منحنى التوتر نشل يوضح التوتر القصوى نشل (ف _ر) ، والوقت الانكماش (CT) ، ونصف الساعة الاسترخاء (HRT). بار ، 1S باء ، مثال على منحنى التوتر كزازي عرض كزازي التوتر القصوى (ف _س) و نصف استرخاء التوتر كزازي (HRTT). بار ، 1S.

الشكل 3. مثال لتحليل علاقة قوة التردد. والتوترات ، التي تم إنشاؤها بواسطة الترددات التحفيز الإضافية. B ، مثال على تدريب نبضة في 30MHz. بار ، 80ms جيم ، مثال على تدريب نبضة في 140MHz. بار ، 80ms دال ، مثال على قوة التردد منحنى المستمدة من البيانات الواردة في ملف. شكل منحنى القوة التردد هو سمة من قوة العضلات ، ويمكن مقارنة بين العضلات من الحيوانات المختلفة.

الشكل 4. مثال التردد المنخفض تحليل التعب. ويرد التوتر ، ولدت بتناقص عدد المشتركين خلال الفترة من stimulation.Examples التردد المنخفض من القطارات في نقاط النبض الزمني المشار إليه (B ، C ، D) أدناه. E ، مثال التردد المنخفض منحنى التعب المستمدة من البيانات الواردة في ملف. شكل منحنى التردد المنخفض التعب هو سمة من قوة العضلات ، ويمكن مقارنة بين العضلات من الحيوانات المختلفة.

Discussion

نحن تصف نهجا مفصلة لتقييم الخصائص الميكانيكية وميو في العضلات hindlimb explanted من الماوس. ومؤسسة كهرباء لبنان ، في حين من الصعب تشريح بسبب موقعها الخلفي وراء العضلات الأمامية الظنبوبي ، هو أسهل لتقييم من الظنبوبي الأمامي بسبب مرفقاتها الوترية بارز في الكاحل والمفاصل في الركبة. هذه الأوتار تسهيل المتصاعد في العضلات myograph القطاع. في المقابل ، زادت سهولة الوصول الظنبوبي الأمامي لديه واسعة ، المرفق atendinous تقريبا في مفصل الركبة ، مما يجعل من الصعوبة بمكان على حد سواء دون المساس تشريح العضلات ، ويشن بأمان في myograph. نشير أيضا إلى أن تصاعد بسرعة العضلات في حمام الاوكسيجين في المخزن الفسيولوجية ودرجة الحرارة لا بد من الحفاظ على خصائص العضلات والميكانيكية. لقد وجدنا أن نتمكن من تكرار هذا التحليل لمدة تصل إلى 30 دقائق من دون تغييرات كبيرة في استجابة العضلات في ظل هذه الظروف. أخيرا ، من الضروري أن ألياف العضلات لا يمكن لمسها خلال تشريح وإجراءات متزايدة ، حيث أن هذا يمكن أن يكون لها آثار سلبية على وظيفة العضلات ، ويؤدي إلى التقليل من ميو الميكانيكية والقوة. باتباع هذه الإجراءات ، فإن هذا التحليل يقدم نهجا قويا الكمية لتقييم الآثار المترتبة على التعديل الوراثي على وظيفة العضلات ^6،7،8،9 ، وكذلك المقارنة بين التدخلات العلاجية في نماذج الماوس من مرض في العضلات ^1،2،3،5 .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 silk sutures	Oasis	MV682	General surgery
Dupont #5 forceps	WPI	500233	General surgery
Hemostat, straight	WPI	501241	General surgery
Iris forceps	WPI	15914	General surgery
Lab Chart software	ADInstruments	Version 7	Data analysis
Muscle Strip Myograph	DMT	820MS	Tension transduction
Operating scissors	WPI	501754	General surgery
Oscilloscope	EZ	OS-5020	Tension stimulation
Pentobarbital, sodium salt	Sigma	P3761	Euthanasia
PowerLab	ADInstruments	8/30	Data acquisition
Square Pulse Stimulator	Grass Tech.	S48	Tension stimulation
Vannas spring scissors	WPI	14003	General surgery
Solutions and Media
Lactated Ringer's solution
100 mM NaCl 30 mM CH3CH(OH)COONa (sodium lactate) 4 mM KCl 1 mM CaCl2 2H2O (calcium chloride dihydrate) adjust pH to 6.75
Krebs Henseleit solution
118 mM NaCl 4.7 mM KCl 1.25 mM CaCl2 1.2 mM MgCl2 1.2 mM KH2PO4 25 mM NaHCO3 11 mM glucose adjust pH to 7.2-7.4 by equilibrating with O2/CO2 (95%/5%) gas
Pentobarbital
5 mg/ mL working solution in sterile water