Summary
Pour évaluer la
Abstract
Pour évaluer les effets in vivo d'interventions thérapeutiques pour le traitement de la maladie du muscle 1,2,3, méthodes quantitatives sont nécessaires pour mesurer et de génération de force dans les muscles traités fatigabilité. Nous décrivons une approche détaillée afin d'évaluer les propriétés mécaniques du myo-dans le muscle des membres postérieurs fraîchement explantées de la souris. Nous décrivons la récolte atraumatique de la souris extenseurs muscle long fléchisseur, le montage du muscle dans une bande de muscle myographe (Modèle 820MS; danoises technologie Myo), et la mesure de la contraction maximale et la tension tétanique, le temps de contraction, et la demi-temps de relaxation, en utilisant un carrés d'impulsion stimulateur (modèle S48; Technologies Grass). Grâce à ces mesures, nous démontrons le calcul de la contraction spécifiques et les tensions musculaires tétaniques normalisée à coupe transversale, la contraction-à-tétaniques ratio de la tension, la courbe de la relation force-fréquence et la courbe de la fatigue de basse fréquence 4. Cette analyse fournit une méthode de comparaison quantitative entre les interventions thérapeutiques dans des modèles murins de la maladie du muscle 1,2,3,5, ainsi que la comparaison des effets de la modification génétique sur la fonction musculaire 6,7,8,9.
Protocol
Le protocole est exécuté avec l'approbation de l'UCSF Soins des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC).
1. Dissection de la souris Longus extenseur des orteils (EDL) Muscle
- Effectuez toutes les procédures animal conformément aux directives institutionnelles.
- Euthanasier des animaux avec 200 mg / kg par voie intrapéritonéale du pentobarbital / col de l'utérus juste avant la dislocation à 10 récoltes de muscle. La dissection doit être bien pratique pour que les muscles peuvent être récoltées et monté dans le transducteur de tension dans les 15 minutes de l'euthanasie.
- Disposer la carcasse en position couchée sur le plateau de dissection et de la jambe broches à plateau.
- Sous jambier microscope à dissection, la peau ouverte, ouvrir avec précaution fascia (Fig.1A), et le zeste de la cheville vers le haut pour exposer les EDL (Fig. 1b). Utilisez des gouttes de solution de Ringer lactate pour garder le muscle humide et tamponnées pendant la récolte.
- Retirer EDL, préservant le tendon autant que possible à chaque extrémité, et mis dans une boîte de Pétri contenant une solution de Ringer lactate. Tie suture pour chacun des tendons des muscles (Fig.1C). Il est essentiel que les fibres musculaires ne pas être touché ou dérangé pendant la dissection.
2. Le montage de l'EDL la souris dans le myographe bande musculaire
- Pour ces études, un bain de tissu est nécessaire qui sécurise le muscle tout en lui permettant de se baigner dans une solution physiologique à température constante avec une oxygénation continue. Le bain est couplé avec un capteur de force pour la mesure de la tension musculaire. Nous employons un bain musculaire intégrés bande myographe du danois Myo Technologie (DMT modèle 820MS) à cet effet. En outre, un stimulateur électrique impulsion carrée (S48 Modèle Grass) et une plateforme d'acquisition de données (ADInstruments PowerLab Système d'acquisition de données et des logiciels LabChart) sont nécessaires pour susciter, enregistrer et analyser les réponses myo-mécaniques, respectivement. La DMT a 820MS électrodes de platine intégré dans le couvercle de la chambre qui sont positionnées de chaque côté du muscle, dans la partie médiane de la bande de muscle. Myographs autres peuvent nécessiter une attention particulière au placement des électrodes.
- Remplissez bain myographe avec 5 ml de solution de Krebs Henseleit 11. Chaude à 25 ° C. Bubble O 2 / CO 2 (95% / 5%) dans le bain pendant 15 minutes avant utilisation.
- Utilisez des sutures à étendre EDL entre les pinces du myographe et sécuriser les tendons du muscle EDL (Fig.1D, E) entre les pinces. Attention à ne pas serrer le muscle lui-même.
- Maintenir bain myographe à 25 ° C.
3. Myo-mécanique Analyse
Tensions Twitch A.
- Réglez la longueur initiale dans le bain afin qu'il n'y ait pas de relâchement musculaire.
- Déterminer relance maximale (durée de 0,5 ms) en ajustant la tension afin d'obtenir la tension maximale contraction, puis réglez de relance à 20% au-dessus maximal (pour atteindre relance supramaximale). Dans nos études, le stimulus supramaximale est habituellement réalisée sur une sortie de 40 volts.
- Vérifiez la sortie du stimulateur à l'aide d'un oscilloscope.
- Déterminer la longueur optimale en mettant graduellement étirer le muscle jusqu'à ce qu'il n'y est aucune autre augmentation de la tension contraction.
- Autoriser musculaire à s'équilibrer pendant 3 min.
- Livrer supramaximale relance carrés (0,5 ms) à longueur optimale à l'aide d'herbe S44 stimulateur électronique, et production record.
- Record: la courbe de tension contraction (P t en fonction du temps; Fig.2a).
B. Tétanos tensions
- Autoriser les muscles de se reposer pendant 3 minutes.
- Appliquer un train de stimuli supramaximale pour 300msec à 150 Hz à longueur optimale à l'aide d'herbe S44 stimulateur électronique, et production record.
- Record: la courbe de tension tétanos (P o vs temps; Fig.2b).
C. force-fréquence
- Autoriser les muscles de se reposer pendant 3 minutes.
- Force-fréquence: appliquer des trains de stimuli supramaximale à 30, 60, 100, 140 et 160 Hz avec 3 minutes de repos entre chaque stimulus (Fig.3). Alternativement, les trains peuvent être appliquées 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 et 160 Hz pour une meilleure résolution à des fréquences inférieures, où les changements force sensiblement.
- Terrain: relation force-fréquence (fréquence maximale de stimulation% vs vigueur).
D. fatigue
- Appliquer train de courte tetani: 60 Hz pendant 300 ms (ou fréquence ajustée pour produire 50% du pic de force), toutes les 3 secondes pendant 10 minutes. En 10 minutes, la force tétanique devrait diminuer à un niveau plateau de ~ 15% de la valeur initiale (Fig.4).
- Terrain: la fatigue de basse fréquence (% temps maximal vs vigueur).
Collecte de données supplémentaires E. à la fin du protocole de
- Avant de démonter le muscle de la myographe, réglez le muscLe moins longueur optimale déterminée à l'étape III.A.4 et mesurer son diamètre en utilisant soit un oculaire sur le microscope ou avec étriers. Calculer section transversale (um 2).
- Mesurer la masse musculaire (mg) par la suppression des sutures et pesant de muscle.
- Peser la souris afin d'évaluer la masse corporelle (GM).
4. Calculs
- Muscle: ratio de masse corporelle =
masse musculaire / masse corporelle - Tensions Twitch, P t (Mn) =
tension maximale produite lors de contraction - Tensions contraction spécifique (N / cm 2) =
tensions contraction (mN) / section transversale (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 - Le temps de la tension de crête (ms) =
le temps entre l'apparition de la contraction de la tension maximale - Demi-temps de relaxation (ms) =
le temps de la tension crête à 50% de la tension maximale - La tension tétanique, P O (mn) =
tension maximale générée pendant le tétanos - Spécifiques tensions tétaniques (N / cm 2) =
tensions tétaniques (mN) / section transversale (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 - Vitesse maximale de montée du tétanos (N / s) =
taux maximum d'augmentation de la tension pendant la montée des tensions dans le tétanos, c'est à dire, la pente maximale de la courbe de la tension tétanique (ou, dP S / dt) - Tensions tétaniques demi-relaxation (ms) =
le temps de la cessation de la stimulation à 50% de la tension à la cessation de la stimulation - Twitch tension au-tétanique ratio de tension, P t / P = O
maximale de tension tétanique contraction de tension / maximum - Indice Fatigue =
rapport de la tension après deux minutes de la fatigue de basse fréquence de la tension isométrique maximale
5. Les résultats représentatifs
Figure 1. La dissection de muscle EDL. Une exposition, des membres postérieurs muscles.TA, jambier antérieur. B, exposition de l'EDL (extensor digitorum longus) musculaire. C, la fixation des points de suture aux tendons EDL. D, bain capteur de tension (vue de côté). E, EDL montés dans le bain (vue de dessus). Le muscle de façon incomplète immergé dans la mémoire tampon à des fins d'illustration, dans la pratique, le muscle doit être complètement immergé pour éviter de se dessécher.
Figure 2. Exemple de courbes de tension. Un exemple, la courbe de la tension contraction illustrant la tension maximale contraction (P t), le temps de contraction (CT) et des demi-temps de relaxation (THS). Bar, 1s. B, Exemple de courbe de la tension tétanique maximale montrant la tension tétanique (P o) et tensions tétaniques demi-relaxation (HRTT). Bar, 1s.
Figure 3. Exemple d'analyse de la relation force-fréquence. Un tensions, fréquences générées par une stimulation supplémentaire. B, Exemple de train d'impulsions à 30MHz. Bar, 80ms. C, Exemple de train d'impulsions à 140MHz. Bar, 80ms. D, Exemple de force-fréquence courbe dérivée de données affichées dans un. La forme de la courbe force-fréquence est caractéristique de la force musculaire, et peut être comparé entre les muscles de différents animaux.
Figure 4. Exemple d'analyse de fréquence sans fatigue. Un tensions, décrémentielle généré plus de période de stimulation.Examples faible fréquence des trains d'impulsions à des moments indiqué (B, C, D) sont indiqués ci-dessous. E Exemple de courbe de fréquence de fatigue faibles issus de données affichées dans un. La forme de la courbe de la fatigue de basse fréquence est caractéristique de la force musculaire, et peut être comparé entre les muscles de différents animaux.
Discussion
Nous décrivons une approche détaillée afin d'évaluer les propriétés mécaniques du myo-dans le muscle des membres postérieurs explantés de la souris. L'EDL, tandis que plus difficiles à disséquer en raison de sa position postérieure derrière le muscle tibial antérieur, est plus facile à évaluer que le jambier antérieur en raison de ses éminents pièces jointes tendineux à la cheville et du genou. Ces tendons faciliter le montage dans la bande de myographe musculaire. En revanche, les plus facilement accessibles jambier antérieur a une large attachement presque atendinous à l'articulation du genou, ce qui rend extrêmement difficile à la fois à décortiquer, sans compromettre le muscle, et monter en toute sécurité dans le myographe. Nous rappelons également que le montage rapide du muscle dans un bain oxygéné dans un tampon physiologique et la température est essentielle pour préserver les propriétés mécaniques du muscle. Nous avons constaté que nous pouvons répéter cette analyse pour un maximum de 30 minutes sans changements importants dans la réponse musculaire dans ces conditions. Enfin, il est essentiel que les fibres musculaires ne pas être touché lors de la dissection et les procédures de montage, comme cela peut avoir des effets néfastes sur la fonction musculaire, et aboutir à une sous-estimation de la myo-force mécanique. En suivant ces procédures, cette analyse offre une approche robuste quantitatives pour évaluer les effets de la modification génétique sur 6,7,8,9 fonction musculaire, ainsi que la comparaison entre les interventions thérapeutiques dans des modèles murins de la maladie du muscle 1,2,3,5 .
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par un Service de santé publique de subvention (HL086513) à partir du NHLBI à PEO, et une subvention de recherche global du California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), un Service de santé publique de subvention (HL085377) à partir du NHLBI, et un cadeau de la Fondation Pollin à HSB
SC a été soutenue par une California Institute for Regenerative Ponts souches Award Cell Research (TB1-01194) à San Francisco State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 silk sutures | Oasis | MV682 | General surgery |
| Dupont #5 forceps | WPI | 500233 | General surgery |
| Hemostat, straight | WPI | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | WPI | 15914 | General surgery |
| Lab Chart software | ADInstruments | Version 7 | Data analysis |
| Muscle Strip Myograph | DMT | 820MS | Tension transduction |
| Operating scissors | WPI | 501754 | General surgery |
| Oscilloscope | EZ | OS-5020 | Tension stimulation |
| Pentobarbital, sodium salt | Sigma | P3761 | Euthanasia |
| PowerLab | ADInstruments | 8/30 | Data acquisition |
| Square Pulse Stimulator | Grass Tech. | S48 | Tension stimulation |
| Vannas spring scissors | WPI | 14003 | General surgery |
Solutions and Media |
|||
Lactated Ringer's solution |
|||
|
|||
Krebs Henseleit solution |
|||
|
|||
Pentobarbital |
|||
|
|||
References
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
- Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
- Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
- MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
- Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
- Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
- Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
- Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
- Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , Forthcoming (2010).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
- Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).
