Summary
Non-Fouling-PEG Silan-Monoschicht wurde von einzeln adressierbaren ITO-Elektroden auf Glas durch Anlegen einer reduktiven Potential desorbiert. Elektrochemisches Abtragen von PEG-Silan-Schicht aus ITO-Mikroelektroden für die Zelladhäsion erlaubt, in einem räumlich definierten Weise erfolgen, mit zellulären Mustern entsprechenden eng an die Elektrode Muster.
Abstract
Die Fähigkeit, präzise räumliche und zeitliche Kontrolle über Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen Übung ist eine wichtige Voraussetzung für die Montage von mehrzelligen Konstrukte, die als in-vitro-Mimetika von nativen Geweben. In dieser Studie wurden Photolithographie und Nassätzen Techniken verwendet, um einzeln adressierbare Indium-Zinn-Oxid (ITO)-Elektroden auf Glassubstraten zu fertigen. Die Glassubstrate mit ITO-Mikroelektroden wurden mit Poly (ethylenglycol) (PEG) Silan, damit sie Protein-und Zell-resistive geändert. Präsenz von isolierenden PEG-Moleküle auf der Elektrodenoberfläche wurde durch Cyclovoltammetrie beschäftigt Kaliumferricyanid als Redox-Reporter-Molekül nachgewiesen. Wichtig ist, dass die Anwendung der reduktiven Potential Desorption der PEG-Schicht verursacht, was zu einer Regeneration des leitenden Elektrode Oberfläche und das Aussehen der typischen Ferricyanid Redoxpeaks. Die Anwendung der reduktiven Potential entsprach auch der ITO-Elektrode Eigenschaften Umschalten von Zell-Non-Klebstoff auf Zell-Kleber. Elektrochemisches Abtragen von PEG-Silan-Schicht aus ITO-Mikroelektroden für die Zelladhäsion erlaubt, in einem räumlich definierten Weise erfolgen, mit zellulären Mustern entsprechenden eng an die Elektrode Muster. Mikrostrukturierung von mehreren Zelltypen wurde auf diesen Substraten demonstriert. In Zukunft wird die Kontrolle der biointerfacial Eigenschaften durch diese Methode leisten kann, um zelluläre Mikroumgebung durch die Anordnung von drei oder mehr Zelltypen Ingenieur in eine präzise geometrische Konfiguration auf einem optisch transparenten Substrat.
Protocol
Teil I: Die Strukturierung der Elektroden
- Saubere und dehydrierte ITO beschichtete Glasträger wurden mit positiven Fotolack beschichteten
- Die Oberfläche wurde bei 100 ° C gebacken, um Lösungsmittel aus dem Lack entfernen
- Nach dem Backen wurde die Oberfläche mit UV-Licht durch eine Photomaske mit dem Canon Mask Aligner ausgesetzt
- Die belichteten Bereiche wurden in einer Entwicklerlösung entfernt
- Die Oberfläche war hart gebacken, um alle verbleibenden Entwickler Lösung zu entfernen
- Die ITO Regionen, die nicht durch Fotolack Strukturierung geschützt wurden entfernt in einem sauren Ätzmittel geätzt
- Verbleibende Photoresist wurde im Ultraschallbad in Aceton auf die ITO-Elektroden Form entfernt
Teil II: Oberflächenmodifizierung
- Geändert Elektroden sind in einer Plasmakammer gereinigt und modifiziert mit 2% PEG Silan in Toluol. Die Inkubation wird für 2 Stunden durchgeführt, gefolgt von 2 Stunden backen.
Hinweis: Dieser Vorgang erfolgt in einem Handschuh-Tasche mit Stickstoff gefüllt, um Anwesenheit von Feuchtigkeit zu vermeiden durchgeführt, wie PEG Silan reaktiv gegenüber ist.
Teil III: Elektrochemie
- Stahldrähte sind Elektroden angebracht.
- Die PEG Silan modifizierte Elektroden sind in einer elektrochemischen Zelle in der Lage, elektrochemischen Experimente durchzuführen.
- PEG Silan aus miteinander verbundenen Regionen abgezogen wird mit einem Drei-Elektroden-System in PBS.
Teil IV: Cell Musterung
- Fibroblasten sind mit dem vor kurzem ausgezogen Substraten inkubiert. Nach Inkubation dieser Zellen, die PEG Silan beraubt Regionen messen, aber die Zellen sonst nirgends binden an der Oberfläche.
- Gemusterte Zellen werden in frischem Medium inkubiert und visualisiert mit Hilfe eines Mikroskops.
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Discussion
In diesem Video haben wir die Zelle Musterung auf optisch transparenten Indium-Zinn-Oxid-Elektroden nachgewiesen. Nach Herstellung der ITO-Elektroden mittels Photolithographie, wurden sie mit einem Zell-resistive Monoschicht von PEG Silan modifiziert. Diese Monoschicht wurde desorbiert mit Elektrochemie Wechsel der Oberfläche von Zellen-resistive, Zell-Kleber. Strukturierung von 3T3 Maus-Fibroblasten hat in seinem Video gezeigt worden. Wir haben auch Strukturierung Hepatozyten, primären Zellen und Sternzellen mit der gleichen Technik. Darüber hinaus, indem mehrere einzelne Elektroden können wir erweitern diese Technik, um mehrere Zelltypen zu montieren. Darüber hinaus, durch die Kontrolle der Geometrie der Konstruktion, können die Zellen räumlich und zeitlich auf der Oberfläche isoliert.
Lithografie und Nassätzen Techniken sind Standard Mikrofabrikation Prozesse. Elektrochemie wurde vielfach auf Goldoberflächen studiert, aber nicht so sehr auf ITO. Abgesehen von Leitfähigkeit, ITO bietet auch den Vorteil der Transparenz. Durch die Verwendung von ITO, können die Proben wird über einen einfachen inversen Mikroskop. Die Technik in diesem Video vorgestellt werden können, um jeden Zelltyp an der Oberfläche in einer präzisen geometrischen Muster montieren.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indium Tin Oxide | Other | Delta Technologies | CB 40IN | |
| PEG silane | Reagent | Gelest Inc. | SIM6492.66 | |
| Hydrochloric Acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Nitric Acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 258121 | |
| Ethanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Acetone | Reagent | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Toluene | Reagent | Sigma-Aldrich | 34866 | |
| Media | Reagent | Invitrogen | ||
| Collagen | Reagent | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| 3T3 murine Fibroblasts | Cell Line | ATCC |
References
- Lee, J. Y., Jones, C., Zern, M. A., Revzin, A. Analysis of Local Tissue-Specific Gene Expression in Cellular Micropatterns. Analytical Chemistry. 78, 8305-8312 (2006).
