Summary
Nous discutons de la construction et l'exploitation d'un système optique complexe non linéaire qui utilise ultrarapide tout-optiques de commutation pour isoler Raman de signaux de fluorescence. Grâce à ce système, nous sommes en mesure de séparer les signaux succès Raman et de fluorescence en utilisant des énergies d'impulsion et de puissances moyennes qui restent biologiquement sûrs.
Abstract
Spectroscopie Raman est souvent en proie à un fond fluorescent intense, surtout pour les échantillons biologiques. Si un échantillon est excité par un train d'impulsions ultra-rapides, un système qui peut séparer temporairement spectralement chevauchement des signaux sur une échelle de temps picoseconde permet d'isoler rapidement arriver Raman de la lumière diffusée à partir de fin-lumière de fluorescence qui arrivent. Ici, nous discutons de la construction et l'exploitation d'un système optique complexe non linéaire qui utilise tout-optiques de commutation sous la forme d'un portail de faible puissance Kerr optique d'isoler les signaux Raman et de fluorescence. Une seule 808 nm laser avec 2,4 W de puissance moyenne et de 80 MHz taux de répétition est divisée, avec environ 200 mW de lumière 808 nm étant converti en <5 mW de 404 nm de lumière envoyée sur l'échantillon pour exciter la diffusion Raman. Le reste de lumière inconvertis 808 nm est ensuite envoyé à un milieu non linéaire où il agit comme la pompe pour l'obturateur tout-optique. L'obturateur s'ouvre et se ferme en 800 fs avec une efficacité maximale d'environ 5%. Grâce à ce système, nous sommes en mesure de séparer les signaux succès Raman et de fluorescence à un taux de répétition de 80 MHz en utilisant des énergies d'impulsion et de puissances moyennes qui restent biologiquement sûrs. Parce que le système n'a pas de capacité de réserve en termes de puissance optique, nous détaillons quelques considérations de conception et de l'alignement que l'aide à maximiser le débit du système. Nous discutons également de notre protocole pour l'obtention du chevauchement spatial et temporel du signal et des poutres de pompe dans le milieu Kerr, ainsi que d'un protocole détaillé pour l'acquisition spectrale. Enfin, nous rapportons un des résultats représentatifs de quelques spectres Raman, obtenu en présence d'une forte fluorescence à l'aide de notre temps de déclenchement du système.
Protocol
1. Certaines précautions doivent être prises dans la préparation et à placer un échantillon Raman dans ce système.
- Parce que le système permet généralement l'utilisation d'objectifs très élevés ouverture numérique avec de très courtes distances de travail, les échantillons sont placés sur une lamelle. Les échantillons biologiques sont généralement placés sur une lamelle d'épaisseur n ° 1 monté dans une chambre de la cellule Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA).
- Les échantillons liquides, en particulier ceux toxique pour les humains, sont placés dans une petite bouteille de verre avec une lamelle collée à l'ouverture au moyen d'une résine époxy de silicone. La bouteille est ensuite inversé pour la mesure.
- Parce que notre système repose sur le calendrier précis de la pompe et impulsions du signal, nous sommes contraints de ne pas utiliser le réglage du tirage optique conventionnelle de notre microscope, ce qui traduit l'objectif de haut en bas. Cela ajoute et soustrait du chemin optique de notre système. Au lieu de cela, nous mettons nos échantillons sur une scène secondaire, monté sur le dessus de la platine du microscope qui a son propre contrôle de discussion indépendant.
2. Afin de prendre le temps-dépendants spectres Raman, le faisceau d'excitation doivent être correctement préparés.
- Nous commençons avec la lumière émergeant d'un 2,4 W accordable Ti pulsée: Sapph laser (Chameleon, des systèmes cohérents, Santa Clara, CA). Chaque impulsion dans le train d'impulsions de 80 MHz a 30 nJ d'énergie, a une largeur temporelle de 140 fs, et a un spectre centré à 808 nm avec une bande passante spectrale de ~ 6 nm.
- Pour éviter de back-reflets de revenir dans la cavité du laser, la lumière est passée à travers un isolateur de Faraday. Une lame demi-onde placée avant l'isolateur de Faraday permet de régler en continu de la puissance totale envoyée dans le système.
- Parce que 6 nm est trop large bande passante pour résoudre la plupart des modes Raman, le faisceau est envoyé à travers un filtre passe-bande (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH), très étroite centrée à 808 nm.
- La lumière est ensuite focalisée par un doublet achromatique (f = 100 mm) sur une 5 mm β-borate de baryum (BBO) cristal (CASIX, Fuzhou, Fujian, Chine) pour réduire de moitié la longueur d'onde de 808 à 404 nm nm. Le cristal de BBO est placé dans une monture avec des contrôles pointe et d'inclinaison, et également montés sur une platine de translation. Pour maximiser l'efficacité de la conversion de longueur d'onde, le cristal doit être placé exactement symétrique par rapport à l'objectif du pourpoint, et avec son axe de cristal aligné à la polarisation du faisceau entrant.
- Parce que l'efficacité de la conversion de longueur d'onde est dépendant de la polarisation, le contrôle sur la quantité de lumière envoyée sur l'échantillon peut être obtenue en plaçant une seconde lame demi-onde, après l'isolateur de Faraday. En tournant ce waveplate, l'intensité de la lumière envoyée sur l'échantillon peut être ajusté indépendamment de l'intensité envoyée dans le faisceau de pompe (à discuter ci-dessous).
- La longueur d'onde de lumière est convertie recollimated par un doublet achromatique seconde (f = 500 mm) choisi de telle sorte que le faisceau sortant est assez grand pour remplir l'ouverture arrière de l'objectif du microscope, et dirigé dans un microscope inversé (IX-71, Olympus, Center Valley, Pennsylvanie) au moyen de deux miroirs de pilotage.
- L'objectif de microscope, étant l'élément optique logé dans la composante la plus monolithique du système, définit l'axe optique. Pour aligner le faisceau d'excitation à cet axe, un miroir est placé dans le plan de l'échantillon du microscope. Les deux miroirs de pilotage sont ensuite itérativement à l'écoute tout en observant l'arrière-reflété faisceau laser sur une caméra CCD de l'époque (μEye, IDS, Obersulm, Allemagne) connecté au port d'imagerie du microscope. En supposant que l'image de la caméra est centrée sur le microscope champ de vue, la poutre est dans l'axe lorsque la tache focale est centrée sur la puce de microscope et de traduction de l'objectif le long de l'axe z ne change pas le point central du faisceau défocalisé.
- Quand un échantillon est placé dans le plan de l'échantillon et irradiée avec une lumière laser Raman se produit. Un filtre dichroïque placé sous l'objectif du microscope sépare la longueur d'onde de lumière décalée Raman diffusée (et fluorescence) à partir du faisceau d'excitation, de diriger la lumière Raman éparpillés sur le port côté du microscope. Le microscope a été modifié pour enlever les lentilles dans cette voie, tels que le signal lumineux émerge du microscope collimaté.
- Parce que le faisceau signal sortant de la loupe est plus grand que l'ouverture claire des polariseurs Glan-Thompson, un télescope 0.47x construit de deux doublets achromatiques (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) est utilisé pour réduire la poutre.
- Le signal lumineux est alors polarisée par un polariseur de Glan-Thompson orientés à 0 ° par rapport à la verticale dans le cadre du laboratoire, et dirigé vers un miroir dichroïque où il est recombiné avec le faisceau de pompe.
3. Pour que la porte optique pour fonctionner à plein rendement, il faut prendre soin dans la préparation du faisceau de pompe (Kerr faisceau) aussi bien.
4. Avec les deux faisceaux combinés, la porte de Kerr et le système de collecte sont mis en place pour maximiser le temps-dépendants recueillies signal.
- Les poutres de la pompe et le signal sont d'abord passés par un filtre dichroïque qui a un diamètre extérieur de 6 à 404 nm pour empêcher toute lumière d'excitation résiduelle de diffusion Raman passionnante au sein du milieu non linéaire.
- La pompe et le signal de poutres sont ensuite focalisés par deux un doublet achromatique (f = 35 mm) dans une cuvette de 1 cm de trajet optique de quartz contenant le matériau non linéaire. Tout matériel non linéaires ayant une convenablement haut indice non linéaire (plus élevé que CS 2), et convenablement courte réponse temporelle (<2 PS), peut être utilisé ici. Pour ces expériences, nous utilisons le disulfure de carbone, CS 2, qui a un indice non linéaire n 2 = 3,1 x 10 -18 m 2 / W. La lumière est ensuite recollimated par un second doublet avec une longueur focale identique à la première.
- Les poutres sont ensuite passé à travers et de Glan-Thompson analyseur sur une monture tournante, et ensuite à travers un ensemble de filtres d'absorption et les interférences qui ont combiné une DO de 10 à 808 nm.
- Enfin, le signal lumineux est focalisée par un doublet achromatique (f = 35 mm) dans une fibre de 50 um optique multimode, où la fibre est montée dans un stade qui permet la traduction en x, y et z. La fibre est ensuite couplé à un spectrographe d'imagerie commerciale avec joint caméra CCD (SP2300i et Pixis 100B, respectivement, tous deux fabriqués par Princeton Instruments, Trenton, NJ).
- Pour aligner le système de collecte afin de maximiser le signal recueilli, l'analyseur est réglé à 0 ° et un échantillon test de toluène est placée dans le plan de l'échantillon. En ajustant les x, y, z et les commandes de la monture en fibre, le signal recueilli Raman est optimisé.
- Pour assurer le bon chevauchement spatial et temporel de la pompe et les poutres du signal, un miroir est placé dans le plan de l'échantillon du microscope. Le filtre 404 nm, est retiré du système. Avec l'analyseur de rotation à 90 ° le faisceau 404 nm rétroréfléchie est envoyé dans le spectrographe avec l'intensité ajustée de telle sorte qu'il ne sature pas la caméra. Avec le faisceau pompe, l'analyseur est tourné pour minimiser le signal transmis 404 nm. Avec le faisceau pompe rallumé, le stade de retard est réglé lentement jusqu'à ce que la transmission de la lumière 404 nm commence à augmenter. Puis, par itération tuning au stade de retard, le miroir piézo-électriques, et les x, y, z et les commandes de la fibre, on maximise le signal.
- Parce que la rétro-réfléchie du faisceau 404 nm et la lumière Raman dispersés peuvent prendre des chemins légèrement différents à travers le système, les derniers ajustements sont réalisés en plaçant une forte Raman diffuseur (comme le toluène) sur la scène de l'échantillon et le tordant légèrement l'alignement en modifiant les étage de retard, piezeo-électrique miroir, et les commandes x, y et z de la fibre pour optimiser le signal Raman.
5. Collection d'un seul temps-dépendants spectre Raman nécessite l'acquisition de plusieurs spectres pour corriger les artefacts du système.
- Avec l'analyseur à 0 °, le faisceau d'excitation et de la poutre sur la pompe, un «non synchronisées" spectre est prise, ce qui représente le spectre qui seraient acquis sans l'avantage du système de temps de déclenchement.
- Avec l'analyseur réglé à 90 °, le faisceau d'excitation et le faisceau de pompe toujours éteint, un large arrière-plan est prise, ce qui représente la quantité de lumière parasite qui fuit à travers les polariseurs et d'autres éléments dans le système.
- Avec l'analyseur reste à 90 °et toutes les poutres sur les "gated" spectre est prise, ce qui représente la lumière Raman dispersés autorisé par la polariseurs croisés par la présence du faisceau de pompe.
- Enfin, avec l'analyseur reste à 90 °, le faisceau d'excitation hors tension et le faisceau pompe sur un spectre de fond seconde est prise, ce qui représente la contribution à la "gated" spectre des quantités résiduelles de la lumière 808 nm pénétrant dans le spectrographe.
- De plus, un spectre est pris avec tous les lasers off, caractérisant le niveau de référence au niveau "sombre" du signal de la caméra et l'électronique.
- Parce que les spectres ont souvent besoin de temps d'intégration longs, il est impératif de briser ce temps d'intégration en plusieurs morceaux (frames) pour permettre la correction appropriée des rayons cosmiques - un problème commun lors de l'acquisition de données sur des portées de plusieurs minutes.
6. Une fois acquis, plusieurs étapes de traitement sont utiles pour améliorer la qualité et l'apparence des données.
- Premièrement, tous les spectres sont sombres corrigée en soustrayant au large de la "sombre" du spectre.
- Pour corriger les rayons cosmiques, les cadres de plusieurs constituant une acquisition sont comparées les unes aux autres sur une base pixel par pixel. Pour chaque pixel d'une trame qui tombe en dehors de 2 écarts médians de la valeur médiane pour ce pixel dans tous les cadres, la valeur de ce pixel est remplacé par la valeur médiane pour tous les cadres.
- Les cadres de rayons cosmiques corrigées sont ensuite moyennées et lissée par un filtre Savitzky-Golay 1.
- Pour extraire le "vrai" spectre fermée, on soustrait le «excitation-only" et "pompe seule" spectres du spectre mesuré fermée.
- Enfin, les spectres fermé et non synchronisées sont ensuite fond corrigée en soustrayant une 5 ème ordre polynomial, déterminée selon la méthode de Lieber et Mahadevan-Jansen 2.
7. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Schéma du système de déclenchement Kerr. La trajectoire du faisceau pompe est représentée en rouge, tandis que le chemin SHG est représentée en bleu. Le chemin où Raman et de fluorescence sont superposées est représenté en vert, tandis que le chemin où la fluorescence a été temporellement filtré est représenté en jaune. Abréviations comme suit: BPF, filtre passe-bande; CCD, charge-coupled device; DCM, miroir dichroïque; FI, Faraday isolateur; λ / 2, la plaque demi-onde; LPF, filtre passe-temps; NLM, milieu non linéaire; P, polariseur ; SHG, cristal génération de second harmonique.
Figure 2 Haut:. Spectres bruts de coumarine dissous dans l'huile d'immersion. La courbe rouge représente le spectre d'prises avec le portail ouvert (analyseur fixé pour une transmission maximale). Courbe noire montre le spectre pris avec l'analyseur aligné pour la transmission minimum et un faisceau de pompe appliquée (le spectre gated). Courbe bleue montre les spectum prises avec l'analyseur aligné pour la transmission minimum et aucun faisceau de pompe appliquée (portail maintenu fermé). Courbe verte montre le spectre pris avec seulement le faisceau de pompe appliquée. Lignes magenta pointillés indiquent la région spectrale représentée dans le panneau ci-dessous. Tous les spectres ont été lissés avec un point 11, 3ème ordre Savitzky-Golay filtre. En bas: spectres de coumarine dissous dans de l'huile d'immersion après la fluorescence soustraction du fond. La courbe rouge est le spectre avec la porte maintenue ouverte, et la courbe bleue est le spectre fermée. Le spectre montre clairement les gated pic caractéristique alambiqué haute onde d'huiles.
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Discussion
Le domaine de la spectroscopie Raman biomédicale a constaté un intérêt croissant au cours des dernières années en raison de son potentiel démontré pour résoudre plusieurs défis difficiles dans le diagnostic biologique. Par exemple, les spectres Raman ont été montré pour avoir une valeur diagnostique dans le cancer de détection 3, 4, 5, 6. La spectroscopie Raman a également été utilisée dans la quantification bactérienne 7, 8 et 9 réponse aux médicaments bactérienne. Il a également trouvé des applications dans un large éventail d'autres applications biomédicales allant de 10 à la santé osseuse des fluides biologiques d'analyse 11, 12.
Malgré un grand potentiel, toutefois, la spectroscopie Raman a une grande barrière à surmonter dans la plupart des systèmes biologiques: sa très faible section. Par conséquent, les signaux Raman peut être facilement submergés par même assez modestes origines fluorescentes. De nombreuses techniques existent pour éliminer la fluorescence LineShape 2, 13, 14. Cependant, aucune de ces techniques véritablement régler le problème principal avec une solide formation fluorescentes; le coup de bruit contribué au spectre par la présence de la submerge fond fluorescent le signal Raman et ne peut être soustraite de suite. Plusieurs techniques, telles que anti-Stokes cohérente spectroscopie Raman (CARS) et la diffusion Raman stimulée (ou inverse diffusion Raman), ont été développés pour tenter d'amplifier la force du signal Raman 15, 16, 17. Cependant, toutes ces techniques sont principalement applicables aux échantillons transparents et ont leurs propres origines et les problèmes de sensibilité aux produits chimiques 18.
Protéger le détecteur de signal de fluorescence est la seule façon de vraiment rejeter le bruit de grenaille associé au fond de fluorescence dans la diffusion Raman spontanée. Plus il ya une décennie, Matousek et al. démontré le rejet de fluorescence à l'aide d'un obturateur ultrarapide Kerr à isoler les signaux temporellement Raman et de fluorescence 19, 20. Toutefois, à ce jour, ce système n'a pas trouvé une utilisation largement répandue dans le domaine biologique en raison de la nécessité pour les énergies d'impulsion excessivement élevés. Le système présenté dans cette communication, en revanche, utilise 1000 fois plus faible que les énergies d'impulsion des rapports précédents et il est compatible avec les systèmes biologiques.
Notre système, montré à la figure 1 utilise un colinéaires Kerr porte la géométrie pour économiser l'énergie et de fournir en beaucoup de chevauchement entre la pompe et les poutres du signal dans le milieu non linéaire que possible. En outre, nous prenons soin de réduire les pertes optiques, autant que possible pour s'assurer que nous avons la puissance maximale disponible pour faire fonctionner nos obturateur de Kerr. L'utilisation de ce système que nous avons obtenu des spectres Raman de haute fluorescence des échantillons biologiques, à savoir une tige de la plante de jasmin, sans observation de tout photodommages 21. Dans ce rapport, nous montrons quelques données représentatives sur un système modèle d'un fluorophore à base de plantes (coumarine, τF ≈ 5 ns) dissous dans l'huile d'immersion du microscope. Ceci est illustré dans la figure 2. Dans le panneau du haut, on voit la forte «non synchronisées" spectre (analyseur mis à 0 °) en rouge, ramenés à 0,04% de sa valeur maximale à des fins de visualisation. Notez qu'il n'ya pas de pics discernables Raman visible. Ci-dessous, en noir, est le spectre brut fermée (c'est à dire le spectre à la fois avec la pompe et d'excitation des lasers sur). En dessous, en bleu, est le spectre avec juste le laser d'excitation sur le représentant de fluorescence résiduelle qui fuit à travers les polariseurs croisés. Enfin, en vert, nous voyons le fond dû à la pompe laser fuite à travers la combinaison de filtres d'absorption et les interférences placé dans le système. Dans le bas de la figure 2, nous voyons une sous-région du spectre non synchronisées et fermé (région indiquée par des lignes en pointillé magenta dans le panneau supérieur), après soustraction d'un polynôme du 5e ordre. Le spectre montre clairement fermée le pic onde élevés associés à des lipides, tandis que le spectre n'a pas non synchronisées caractéristiques claires Raman.
Bien que notre système ne fonctionne pas avec effciency grande à l'heure actuelle (transmission maxiumum mesurée a été de 5%), la force du signal absolu est généralement moins important que le signal-bruit. Il existe plusieurs grandes catégories d'échantillons biologiques pour lesquels la mesure conventionnelle spectres Raman est difficile ou impossible en raison d'antécédents écrasante fluorescence. Pour ces échantillons, notre système peut fournir un signal de définitive-bruit d'amélioration, comme on le voit clairement dans la Figure 2.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la NSF prix DBI 0852891. Une partie de ce travail a également été financée par le Centre pour la science et la technologie biophotonique, un désigné NSF Science et Technology Center géré par l'Université de Californie, Davis, sous l'accord de coopération n ° PHY0120999.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lenses | Thorlabs Inc. | Various | All lenses coated to have maximum transmission losses of 1% each |
| Tunable Ti:Sapph laser | Coherent Inc. | Chameleon | 30 nJ, 200 fs, 80 MHz |
| 40X oil immersion objective | Olympus Corporation | UApo/340 | NA = 1.35 |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX-71 | Modified to remove all lenses in side port |
| Half wave plate | Thorlabs Inc. | AHWP05M-600 | |
| Glan-Thompson polarizer | Thorlabs Inc. | GTH10M | ∼10% transmission loss |
| Spectrometer | Princeton Instruments/Acton | SP2300i | |
| CCD | Princeton Instruments/Acton | Pixis 100B | |
| Mathmatical software | Mathworks | MATLAB | version 2008a |
| Faraday isolator | EOT | BB8-5I | |
| Piezo-electric mirror | Newport Corp. | AG-M100 | |
| BBO crystal | CASIX | custom | 1 mm thickness |
| Bandpass filter 1 | Andover | 008FC14 | 808 ± 0.4 nm |
| Dichroic mirror | Semrock | FF662-FDI01 | band edge at 662 nm |
| Long-pass filter | Semrock | BLP01-405R | band edge at 417 nm |
| Bandpass filter 2 | Semrock | FF02-447/60 | 417-447 nm |
| CS2 | Sigma-Aldrich | 335266 | 99% purity |
| Coumarin 30 | Sigma-Aldrich | 546127 | 99% purity |
| Immersion oil | Cargill Labs | 16242 | Type DF |
References
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