Покадровый Живая съемка клонально Связанные нейронные клетки-предшественники в развивающихся данио рерио переднего мозга

Summary

Настоящий видео демонстрирует метод, который использует сочетание электропорации и конфокальной микроскопии выступать с концертами изображений на отдельных нейронных клеток-предшественников в развивающихся данио переднего мозга.

Abstract

Точные модели разделения, миграции и дифференциации нервных клеток предшественников имеют решающее значение для правильного развития и функционирования мозга ^1,2. Чтобы понять поведение нейронных клеток-предшественников в комплексе в среду естественных условиях, замедленная съемка живых нейронных клеток-предшественников в интактном мозге является критически необходимо. В этом видео мы используем уникальные особенности данио эмбрионов для визуализации развитие переднего мозга нейронных клеток-предшественников в естественных условиях. Мы используем электропорации с генетически и редко этикетке отдельных нервных клеток-предшественников. Короче говоря, ДНК-конструкции кодирования для люминесцентных маркеров вводили в желудочек переднего мозга от 22 часов после оплодотворения (HPF) данио эмбрионов и электрические импульсы были доставлены сразу. Шесть часов спустя, электропорации эмбрионов данио были установлены с низкой температурой плавления агарозы в блюдах со стеклянным дном культуры. Флуоресцентно меченых предшественников нервных клеток были тогда отображаемого для 36hours с фиксированными интервалами по конфокальной микроскопии с использованием воды погружением объектива. Настоящий метод дает возможность получить представление в естественных условиях развитие переднего мозга нейронных клеток-предшественников и может быть применен к другим частям центральной нервной системы эмбриона полосатого данио.

Protocol

1. Подготовка данио рерио Эмбрионы

1. За два дня до электропорации, созданная спаривания клетки диких рыб типа с помощью делителя отделить самцов от самок.
2. За день до электропорации, потяните делителей спаривания клетки от предыдущего дня.
3. Сбор эмбрионов и инкубировать 50 оплодотворенных эмбрионов в 30 мл эмбриональной среде, содержащей 0,003% фенилтиомочевиной (ПТУ) при 28,5 ° C.
4. В день электропорация, dechorionate эмбрионов вручную с мелкими щипцы (Inox 5, Дюмон Electronic, Швейцария), когда эмбрионы достигают стадии развития 22hpf. Затем трансфер эмбрионов до ³ 10мл электропорации Рингера (180 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2, 5 мМ рН Hepes 7,2), содержащий 0,003% ПТУ.
5. Добавить 420 мкл tricaine акций (4mg/ml), чтобы электропорация 10мл звонка, чтобы обезболить эмбрионов.

2. Подготовка к Электропорация

1. Иглы стекла инъекции были выведены из капилляров (1,2 мм диаметр, 0,9 мм ID, с нитью) на Flaming-Браун P897 съемник (Саттер Instruments, Новато, Калифорния, США). Иглы были прерваны щипцами, чтобы получить острым концом, как показано на рисунке 1D. Диаметр наконечника должен быть около 10 мкм и угол конуса должна быть около 30 градусов.
2. Подготовка 0,8% и 1% низкой температурой плавления агарозы (Шелтон Научные, Inc каталога # IB70050) в растворе электропорации Рингера. Алиготе решение агарозы в 2 мл пробирок микроцентрифужных. Имейте в аликвот тепла блока при температуре ~ 37 ° C.
3. Система Gal4/UAS используется для привода экспрессию генов в нервных клеток-предшественников из электропорации эмбрионов. Два плазмиды используются: плазмиды EF1α-GFF-PT2KXIG, в котором Gal4FF обусловлена ​​повсеместным EF1α промоутер, и плазмиды UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG.
4. Подготовка EF1α-GFF-PT2KXIG и UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG плазмидой ДНК с использованием GenEluteTM HP плазмиды Midiprep Kit (Sigma).
5. Плазмиды затем концентрируется ацетата натрия / этанол осадков конечной концентрации 1-2 мкг / мкл в 10 мМ Трис · Cl (рН 8,5).
6. Смешайте две плазмиды и разбавить нуклеазы без H2O до конечной концентрации 500 нг / мкл для каждого плазмиды. Добавление фенола красного (разбавленного 1 / 10 общего объема), чтобы решение является предпочтительным для визуализации доставки. Хранить раствор ДНК на льду.
7. Прямо перед электропорация, backload инъекционной иглой с 2 ​​мкл раствора ДНК и регулировать объемом впрыска до 2 п.

3. Электропорация

1. Микроскоп стерео рассечение (Zeiss Stemi 2000 году с максимальным увеличением 50х), давление воздуха инжектор (Narishige IM 300 microinjector), два микроманипуляторами (WPI M3301R, инструменты Всемирного Precision, Сарасоте, штат Флорида, США), и электрический стимулятор (SD9 прямоугольного импульса стимулятора, Грасс Tlefactor, West Warwick, Род-Айленд, США) создаются как показано на Рисунке 1A.
2. Чтобы смонтировать эмбрионов, погрузиться 2 эмбрионов в 1% низкой температурой плавления агарозы. Затем немедленно удалить эмбрионов из агарозы со стеклянной пипетки.
3. Место эмбрионов на перевернутую чашку Петри пластиковые крышки в отдельные капли агарозы. Ориентироваться эмбрионы осторожно волокна зонд к спинной положении вверх до агарозном затвердевает так, что передний мозг является доступным и для электродов и микроинъекции иглы (рис. 1В). Эмбрионы должны быть установлены в отдельных агарозном капель.
4. Манипулирование электродов с левой микроманипулятора. Вставить электроды в агарозном как показано на Рисунке 1B. Custom платины иридий параллельными электродами биполярного 125 мкм в диаметре и 500 мкм, расположенных друг от друга используются для электропорации (FHC, каталог # PBSA0575).
5. Вставьте микроинъекции иглу в желудочек мозга и вводят 4nl смеси ДНК, как течет красно жидкости и отеки желудочка может наблюдаться.
6. Сразу же, одно 28,5 V импульса длительностью 1 миллисекунду был применен вручную. Затем полярность и применять еще один 28,5 V импульса длительностью 1 мс. Это приведет к двусторонним маркировки мозаику переднего мозга нейронных клеток-предшественников.
7. После электропорации 10 эмбрионов, добавьте 5 мл эмбрионального среда для покрытия эмбрионов и кожуры агарозы с микрохирургической нож, чтобы освободить эмбрионов.
8. Передача электропорации эмбрионов свежие блюда по 30 мл эмбриональной среде, содержащей 0,003% ПТУ и инкубировать при 28,5 ° C.

4. Монтаж и Покадровый Живая изображений

1. Примерно через 4 часа после электропорации, сигнал EGFP наблюдается, если рассматривать под микроскопом epifluorescent вскрытии.
2. Через пять часов после электропорации, выберите эмбрионов с высокой мозаики, но сильное выражение EGFP в области переднего мозга.
3. Передача выбранного эмбрионов 10мл эмбриональной среде, содержащей 0,003% ПТУ.
4. Добавить 420 мкл tricaine акций (4mg/ml) до 10 мл эмбриональной среде то обезболить эмбрионов.
5. Чтобы смонтировать эмбрионов, погрузиться 1 эмбриона в 0,8%, низкой температурой плавления агарозы. Затем немедленно удалить эмбрион из агарозы со стеклянной пипетки и место эмбриона в центре 35-мм блюдо нижней культуры стекла (Маттек корпорацию, часть # P35GC-1.5-10-C, www.glass-снизу dishes.com ) .
6. Ориентироваться эмбрионы осторожно волокна зонд к спинной положении вверх до агарозном затвердевает.
7. Место блюдо должным образом на контролируемой температурой этапе конфокальной микроскопии, как показано на рисунке 1C (Мы используем Nikon C1 спектральных конфокальной микроскопии с самыми право цели). Отрегулируйте температуру до 28,5 ° C.
8. Добавить 3 мл 28,5 ° C разогретой эмбриональной среде, содержащей 0,003% ПТУ, чтобы покрыть эмбриона. Эмбрион готов для работы с изображениями.
9. Выполните покадровой жить изображений с фиксированным интервалом использованием воды погружения цели.

5. Представитель Результаты

Показанный на рисунке 2 выбираются кадры замедленной конфокальной жить визуализации эмбриона электропорации из EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP в 22 HPF.

Рисунок 1. Аппарат настройки. (А) сборка электропорации оборудование: Трава SD9 прямоугольного импульса стимулятора (я), левая микроманипулятора (II), электродов (III), Zeiss рассекает микроскоп (IV), инъекционной иглой (у), право микроманипулятора (VI) и Narishige IM 300 microinjector (VII). (Б) взаимное расположение электродов (я), передний мозг желудочка (II) и инъекционной иглой (III). Обратите внимание, красного цвета раствора ДНК была введена в желудочек мозга. (C) сборки живого изображения на Nikon C1 конфокальной микроскопии: регулятор температуры (я), вода погружения цель длина (II) и электропорации эмбриона встроенные в низкой температурой плавления агарозы в культуре со стеклянным дном блюдо (III) (D ) Изображение вытащил и сократить игла для микроинъекции ДНК.

Рисунок 2. Выбранный рамках 18-часовой покадровой конфокальной жить визуализации эмбриона электропорации с EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP в 22 HPF. Желудочка поверхность находится на нижней стороне каждого кадра. Шкала бар составляет 10 мкм.

Discussion

В этом видео мы продемонстрируем метод покадровой жить визуализации нейронных клеток-предшественников в клональных уровне в развивающихся данио переднего мозга. Мы проверили и изменение существующих протоколов электропорации ^4-6 до генетически и флуоресцентно этикетке отдельных нервных клеток-предшественников. Родословная дерево состоит из клонально связанных клетки потомства может быть установлена, так как только немногие клетки редко помечены относительно низкие напряжения электропорации. В дополнение к EGFP, нейронных клеток-предшественников можно subcellularly помечены различные флуоресцентные белки, просто заменив EGFP с другими флуоресцентными маркерами. Например, если EF1α-GFF был одним из электропорации с UAS-E1B-memberane-EGFP и UAS-E1B-H2B-mRFP, мембран отдельных клеток-предшественников будут помечены зеленым флуоресцентным белком в то время как ядро ​​будет помечена красным флуоресцентным белком. Большинство меченых клеток-предшественников, здоровы, о чем свидетельствует общее нормальное развитие эмбрионов и электропорации несколько апоптоза наблюдается во время живого изображения. Исключительно важно также использовать низкие концентрации агарозы для монтирования эмбриона и использование минимальной мощности лазера в течение конфокальной жить отображения, чтобы сохранить клетки здоровые. Настоящий метод может быть применен и к другим частям центральной нервной системы, такие как задние мозга и спинного мозга. Однако этот метод не может быть применен на эмбрионах моложе 18 ФВЧ, поскольку ДНК-конструкции должны быть введены в желудочке для электропорации.