El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo. En vivo El análisis del desarrollo de las células progenitoras neurales del cerebro anterior a nivel clonal se puede lograr de esta manera.
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Artículo de método
Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra
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Resumen
Resumen
Patrones precisos de la división, migración y diferenciación de las células progenitoras neuronales son cruciales para el desarrollo apropiado del cerebro y 1,2 función. Para entender el comportamiento de las células progenitoras neurales en el complejo en un entorno vivo, time-lapse de imágenes en vivo de las células progenitoras neuronales en un cerebro intacto es críticamente necesario. En este video, explotar las características únicas de embriones de pez cebra para visualizar el desarrollo de las células progenitoras neurales del cerebro anterior en vivo. Usamos la electroporación de genética y escasamente etiqueta individual células progenitoras neurales. En pocas palabras, construcciones de ADN que codifican para los marcadores fluorescentes se inyecta en el ventrículo del cerebro anterior de 22 horas después de la fecundación (HPF) embriones de pez cebra y pulsos eléctricos fueron entregados inmediatamente. Seis horas más tarde, los embriones de pez cebra electroporación fueron montadas con bajo punto de fusión de agarosa en placas de cultivo de fondo de cristal. Marcado con fluorescencia células progenitoras neurales fueron estudiados luego de 36 horas con intervalos fijos con un microscopio confocal con agua sumergiendo la lente objetivo. El presente método proporciona una forma para obtener información sobre el desarrollo en vivo de las células progenitoras neurales del cerebro anterior y se puede aplicar a otras partes del sistema nervioso central del embrión de pez cebra.
Protocolo
1. Preparación de los embriones de pez cebra
- Dos días antes de la electroporación, creado jaulas de apareamiento de los peces de tipo salvaje con divisores para separar los machos de las hembras.
- Un día antes de la electroporación, tire de los separadores en el apareamiento de las jaulas del día anterior.
- Recoger los embriones e incubar 50 embriones fecundados en el medio de 30 ml que contienen embriones 0,003% feniltiourea (PTU) a 28,5 ° C.
- En el día de la electroporación, dechorionate los embriones de forma manual con unas pinzas finas (5 Inox, Dumont electrónico, Suiza), cuando los embriones llegan a la etapa de desarrollo ....
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Discusión
En este vídeo, se demuestra un método para time-lapse en vivo de células progenitoras neurales a nivel clonal en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo. Hemos probado y modificar los protocolos existentes electroporación 4-6 a genética y fluorescencia etiqueta individual células progenitoras neurales. Un árbol genealógico compuesto de células de la progenie clonal relación se puede establecer, ya que sólo unas pocas células se marcaron con un poco de tensión relativamente baja de la electroporación. Adem.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por theNIH grantNS042626. Damos las gracias a Thorn Kurt y UCSF Nikon Imaging centro de asistencia con las imágenes.
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Referencias
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- G#246;tz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).
- Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V.
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Reimpresiones y permisos
