Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Summary

El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo.

Abstract

Patrones precisos de la división, migración y diferenciación de las células progenitoras neuronales son cruciales para el desarrollo apropiado del cerebro y ^1,2 función. Para entender el comportamiento de las células progenitoras neurales en el complejo en un entorno vivo, time-lapse de imágenes en vivo de las células progenitoras neuronales en un cerebro intacto es críticamente necesario. En este video, explotar las características únicas de embriones de pez cebra para visualizar el desarrollo de las células progenitoras neurales del cerebro anterior en vivo. Usamos la electroporación de genética y escasamente etiqueta individual células progenitoras neurales. En pocas palabras, construcciones de ADN que codifican para los marcadores fluorescentes se inyecta en el ventrículo del cerebro anterior de 22 horas después de la fecundación (HPF) embriones de pez cebra y pulsos eléctricos fueron entregados inmediatamente. Seis horas más tarde, los embriones de pez cebra electroporación fueron montadas con bajo punto de fusión de agarosa en placas de cultivo de fondo de cristal. Marcado con fluorescencia células progenitoras neurales fueron estudiados luego de 36 horas con intervalos fijos con un microscopio confocal con agua sumergiendo la lente objetivo. El presente método proporciona una forma para obtener información sobre el desarrollo en vivo de las células progenitoras neurales del cerebro anterior y se puede aplicar a otras partes del sistema nervioso central del embrión de pez cebra.

Protocol

1. Preparación de los embriones de pez cebra

1. Dos días antes de la electroporación, creado jaulas de apareamiento de los peces de tipo salvaje con divisores para separar los machos de las hembras.
2. Un día antes de la electroporación, tire de los separadores en el apareamiento de las jaulas del día anterior.
3. Recoger los embriones e incubar 50 embriones fecundados en el medio de 30 ml que contienen embriones 0,003% feniltiourea (PTU) a 28,5 ° C.
4. En el día de la electroporación, dechorionate los embriones de forma manual con unas pinzas finas (5 Inox, Dumont electrónico, Suiza), cuando los embriones llegan a la etapa de desarrollo de 22hpf. Luego, transferir los embriones al ³ de 10ml electroporación Ringer (180 mM NaCl, KCl 5 mM, CaCl2 1,8 mM, 5 mM HEPES pH 7,2) que contiene un 0,003% de PTU.
5. Añadir 420 l de valores tricaína (4mg/ml) a la electroporación de 10 ml de Ringer para anestesiar a los embriones.

2. Preparación para la electroporación

1. Agujas de vidrio de la inyección fueron sacados de los capilares (1,2 mm de diámetro exterior, 0,9 mm de diámetro, con filamento) en un extractor de Flaming P897-Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, EE.UU.). La punta de la aguja se rompió con las pinzas para obtener una línea de combate, como se muestra en la Figura 1D. El diámetro de la punta debe estar alrededor de 10 micras y el ángulo de inclinación debe ser alrededor de 30 grados.
2. Prepare un 0,8% y 1% de bajo punto de fusión de agarosa (Shelton Scientific, Inc. Catálogo # IB70050) en solución de Ringer electroporación. Alícuota de la solución de agarosa en tubos de 2 ml microcentrífuga. Mantener las alícuotas en un bloque de calor a ~ 37 ° C.
3. El sistema GAL4/UAS se utiliza para conducir la expresión de genes en las células progenitoras neurales de embriones electroporated. Dos plásmidos se utilizan: plásmido EF1α-GFF-PT2KXIG, en el que Gal4FF es impulsado por el promotor EF1α todas partes, y el plásmido UAS-E1B-EGFP PT2KXIG.
4. Prepare EF1α-GFF-PT2KXIG y UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG ADN plásmido con GenEluteTM HP plásmido Kit Midiprep (Sigma).
5. Los plásmidos se concentra entonces en acetato de sodio / etanol precipitación a la concentración final de 2.1 mg / l en 10 mM Tris Cl (pH 8,5).
6. Mezcla de los dos plásmidos y diluir con nucleasa libre de H2O a una concentración final de 500 ng / l para cada plásmido. Además de rojo fenol (diluido volumen 1 / 10 en total) a la solución es el preferido para la visualización de la entrega. Mantenga la solución de ADN en el hielo.
7. Justo antes de la electroporación, retrocarga la aguja de inyección con dos l solución de ADN y ajustar el volumen de inyección de 2 nl.

3. Electroporación

1. Un microscopio de disección stero (Zeiss Stemi 2000 con una ampliación máxima de 50x), una presión de inyector de aire (Narishige IM 300 microinyector), dos micromanipulador (WPI M3301R, Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL, EE.UU.), y un estimulador eléctrico (SD9 pulso cuadrado estimulador Grass Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, EE.UU.) se configuran como se muestra en la Figura 1.
2. Para montar los embriones, se sumergen dos embriones en el 1% bajo punto de fusión de agarosa. Inmediatamente después, la toma de embriones a partir de la agarosa con una pipeta de vidrio.
3. Colocar los embriones en una tapa de plástico invertida placa de Petri en gotas individuales de agarosa. Orientar a los embriones con cuidado con una sonda de fibra a una posición dorsal, antes de la agarosa solidifica de manera que el cerebro anterior es accesible tanto para los electrodos y la aguja de microinyección (fig. 1B). Los embriones se debe montar en gotas individuales de agarosa.
4. Manipular los electrodos con el micromanipulador izquierda. Introducir los electrodos en la agarosa, como se muestra en la Figura 1B. Electrodos de platino iridio personalizado paralelo bipolar 125 micras de diámetro y espaciados 500 m además se utilizan para la electroporación (FHC, catálogo # PBSA0575).
5. Inserte la aguja de microinyección en el ventrículo del cerebro anterior y se inyecta la mezcla de ADN 4nl, como el flujo de líquido de color rojo y la inflamación del ventrículo puede ser observado.
6. Inmediatamente, un 28,5 V pulso que dura milisegundos 1 se aplicó de forma manual. Luego invertir la polaridad y aplicar una mayor 28,5 V pulso que dura una milésima de segundo. Esto se traducirá en el etiquetado de mosaico bilateral de las células progenitoras neurales del cerebro anterior.
7. Después de la electroporación de 10 embriones, se añade medio de embriones de 5 ml para cubrir los embriones y la cáscara de la agarosa con un cuchillo de microcirugía para liberar los embriones.
8. La transferencia de los embriones electroporated a un plato fresco de medio de 30 ml que contienen embriones 0,003% PTU y se incuba a 28,5 º C.

4. Montaje y Time-lapse de imágenes en vivo

1. Unas 4 horas después de la electroporación, la señal de EGFP se puede observar si se observa bajo un microscopio de epifluorescencia de disección.
2. Cinco horas después de la electroporación, seleccionar los embriones con un mosaico muy pero la expresión EGFP fuerte en la región del cerebro anterior.
3. La transferencia de los embriones seleccionados para 10 ml medio de embriones que contienen 0,003% PTU.
4. Añadir 420 l de valores tricaína (4mg/ml) a la 10ml embrionarias medio to anestesiar a los embriones.
5. Para montar los embriones, se sumergen en un embrión de bajo punto de fusión del 0,8% de agarosa. A continuación, retire inmediatamente el embrión de la agarosa con una pipeta de vidrio y colocar el embrión en el centro de una placa de cultivo de vidrio de 35 mm de fondo (MatTek corporación, Parte # P35GC-1.5-10-C, www.glass-bottom-dishes.com ) .
6. Orientar a los embriones con cuidado con una sonda de fibra a una posición dorsal, antes de la agarosa solidifica.
7. Coloque el plato correctamente en la etapa de control de temperatura del microscopio confocal, tal como se muestra en la figura 1C (Nosotros usamos un microscopio confocal Nikon C1 espectrales con objetivos arriba-derecha). Ajustar la temperatura a 28,5 ° C.
8. Añadir 3 ml de medio de 28,5 ° C precalentado embrionario que contiene 0,003% PTU para cubrir el embrión. El embrión ya está listo para la imagen.
9. Realizar time-lapse de imágenes en vivo con un intervalo fijo utilizando un objetivo de inmersión de agua.

5. Resultados representante

Se muestra en la Figura 2 se seleccionan los marcos de un lapso de tiempo de imagen confocal en vivo de la electroporación de embriones de EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP en 22 HPF.

Figura 1. Aparato set-up. (A) El montaje de equipos de electroporación: la hierba SD9 estimulador pulso cuadrado (i), el micromanipulador izquierda (ii), los electrodos (iii), el Zeiss microscopio de disección (iv), la aguja de inyección (v), el micromanipulador derecho (vi) y el Narishige IM 300 microinyector (vii). (B) La posición relativa de los electrodos (i), el ventrículo del cerebro anterior (ii) y la aguja de inyección (iii). Tenga en cuenta la solución de ADN de color rojo ha sido inyectado en el ventrículo del cerebro anterior. (C) El montaje de imágenes en vivo en el microscopio Nikon C1 confocal: el controlador de temperatura (i), el agua mojando objetivo len (ii) y el embrión electroporated incrustado en bajo punto de fusión de agarosa en un recipiente de vidrio cultivo de fondo (iii) (D ) de la imagen de una aguja y tiró de corte para la microinyección de ADN.

Figura 2. Fotogramas seleccionados de un joven de 18 horas de lapso de tiempo de imagen confocal en vivo del embrión electroporated con EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP en 22 HPF. La superficie del ventrículo izquierdo es en la parte inferior de cada cuadro de imagen. Barra de escala representa 10 micras.

Discussion

En este vídeo, se demuestra un método para time-lapse en vivo de células progenitoras neurales a nivel clonal en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo. Hemos probado y modificar los protocolos existentes electroporación ^4-6 a genética y fluorescencia etiqueta individual células progenitoras neurales. Un árbol genealógico compuesto de células de la progenie clonal relación se puede establecer, ya que sólo unas pocas células se marcaron con un poco de tensión relativamente baja de la electroporación. Además de EGFP, las células progenitoras neurales pueden ser subcellularly etiquetados con diferentes proteínas fluorescentes, simplemente cambiando EGFP con otros marcadores fluorescentes. Por ejemplo, si EF1α-GFF fue co-electroporación con UAS-E1B memberane-EGFP y UAS-E1B mRFP H2B-, las membranas de las células progenitoras individuales estarán etiquetados con la proteína verde fluorescente, mientras que el núcleo se etiqueta con la proteína fluorescente de color rojo. La mayoría de las células progenitoras de la etiqueta son saludables como lo demuestra el desarrollo general normal de los embriones electroporated y apoptosis observada en algunas imágenes en vivo. También es fundamental utilizar una baja concentración de agarosa para montar el embrión y el uso de un láser de potencia mínima durante la visualización de imagen confocal en vivo para mantener las células sanas. La presente técnica puede aplicarse también a otras partes del sistema nervioso central como el cerebelo y la médula espinal. Sin embargo, esta técnica no se puede aplicar sobre los embriones de menos de 18 HPF, ya que las construcciones de ADN que se inyecta en el ventrículo de la electroporación.