Summary
הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.
Abstract
דפוסים מדויקים של הגירה החלוקה, ואת הבידול של ובתאים עצביים חיוניים להתפתחות המוח תקין 1,2 לתפקד. כדי להבין את ההתנהגות של ובתאים עצביים במתחם בסביבה vivo, זמן לשגות הדמיה חיה של ובתאים עצביים במוח שלם נדרש אנושות. בסרטון זה, אנו מנצלים את התכונות הייחודיות של עוברי דג הזברה כדי לחזות את התפתחותם של תאים עצביים forebrain אבי in vivo. אנו משתמשים כדי electroporation גנטית בדלילות הפרט תווית תאים עצביים אבי. בקצרה, בונה DNA המקודד סמנים ניאון הוזרקו החדר forebrain של 22 שעות שלאחר ההפריה (hpf) עוברי דג הזברה פולסים חשמליים נמסרו מיד. שש שעות מאוחר יותר, עוברי דג הזברה electroporated היו רכוב עם נקודת התכה נמוכה agarose בתרבות צלחות זכוכית התחתונה. שכותרתו fluorescently ובתאים עצביים הם צילמו אז עבור 36hours עם במרווחי זמן קבועים תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות טבילה במים העדשה אובייקטיבי. השיטה הנוכחית מספק דרך להשיג תובנות בפיתוח vivo של תאים ובתאים forebrain עצביים יכול להיות מיושם על חלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית של העובר דג הזברה.
Protocol
1. הכנה של עוברים דג הזברה
- יומיים לפני electroporation, להקים כלובי דגים ההזדווגות של סוג בר באמצעות מחיצות כדי להפריד בין זכרים לנקבות.
- יום אחד לפני electroporation, למשוך את חוצצים ב ההזדווגות כלובים מן היום הקודם.
- איסוף עוברים דגירה 50 עוברי מופרית בתווך העוברי המכיל 30 מ"ל phenylthiourea 0.003% (PTU) על 28.5 ° C.
- ביום electroporation, dechorionate את העוברים באופן ידני עם מלקחיים קנס (Inox 5, דומון אלקטרונית, שוויץ), כאשר העוברים מגיעים לשלב ההתפתחותי של 22hpf. ואז להעביר את העוברים עד 3 10ml electroporation של הצלצול (180 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 1.8 מ"מ CaCl2, 5 pH Hepes mM 7.2) המכיל 0.003% PTU.
- הוסף 420 μl tricaine מניות (4mg/ml) כדי electroporation 10ml הצלצול של להרדים את העוברים.
2. הכנה electroporation
- מחטים זכוכית זריקה נשלפו מן הנימים (1.2 מ"מ OD, 0.9 מזהה מ"מ, עם נימה) על Flaming-P897 חולץ בראון (סאטר מכשירים, Novato, קליפורניה, ארה"ב). קצה המחט נותק עם מלקחיים כדי לקבל סוף חדה כפי שמוצג 1D דמות. קוטר קצה צריך להיות סביב 10 מיקרומטר וזווית להתחדד צריך להיות סביב 30 מעלות.
- הכן 0.8% ו -1% נקודת התכה נמוכה agarose (Shelton מדעיים, Inc קטלוג # IB70050) בתמיסה electroporation של הצלצול. Aliquot agarose פתרון 2 צינורות microcentrifuge מ"ל. שמור את aliquots בתוך גוש חום ~ 37 ° C.
- המערכת Gal4/UAS משמש כונן ביטוי גנים ובתאים עצביים העוברים electroporated. שני פלסמידים משמשים: פלסמיד EF1α-GFF-PT2KXIG, שבו Gal4FF הוא מונע על ידי EF1α מקדם בכל מקום, ואת הפלסמיד כטב"מ-E1B-EGFP-PT2KXIG.
- הכן EF1α-GFF ו-PT2KXIG כטב"מ-E1B-EGFP PT2KXIG-DNA פלסמיד באמצעות GenEluteTM HP פלסמיד Midiprep Kit (Sigma).
- פלסמידים מרוכזים מכן על ידי משקעים נתרן אצטט / אתנול בריכוז הסופי של 1-2 מיקרוגרם / μl ב 10 mM טריס · Cl (PH 8.5).
- מערבבים את שני פלסמידים לדלל עם nuclease ללא H2O לריכוז סופי של 500 ng / μl עבור כל פלסמיד. תוספת של פנול אדום (בדילול מלא 1 / 10 הנפח הכולל) לפתרון היא המועדפת עבור להדמיה של הלידה. שמור את פתרון ה-DNA על הקרח.
- ממש לפני, electroporation backload מחט הזריקה עם פתרון ה-DNA 2 μl לכוונן את עוצמת הזריקה עד 2 nl.
3. Electroporation
- מיקרוסקופ לנתיחה stero (STEMI Zeiss 2000 עם הגדלה מקסימלית של 50x), מזרק בלחץ אוויר (Narishige IM microinjector 300), שני micromanipulators (WPI M3301R, מכשירים Precision העולם, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב), וכן גירוי חשמלי (SD9 רבוע ממריץ הדופק, דשא Tlefactor, מערב וורוויק, רוד איילנד, ארה"ב) מוגדרים כפי שמוצג באיור 1 א.
- להר עוברים, לטבול 2 עוברים 1% נקודת התכה נמוכה agarose. מיד לאחר מכן להסיר את העוברים מן agarose עם פיפטה זכוכית.
- מניחים את העוברים על מכסה פלסטיק צלחת פטרי הפוכה בטיפות בודדות של agarose. להתמצא עוברים בעדינות עם בדיקה סיבים למצב הגבי-up לפני agarose מבצרת כך forebrain נגיש הן אלקטרודות מחט microinjection (איור 1B). עוברים חייב להיות מותקן בתוך agarose טיפות בודדות.
- לתפעל את האלקטרודות עם micromanipulator שמאל. הכנס את האלקטרודות לתוך agarose כפי שמוצג באיור 1 ב. אישית אירידיום ופלטינה מקביל אלקטרודות דו קוטבית 125 מיקרומטר בקוטר 500 מיקרומטר ברווח מזה משמשים electroporation (fhc, קטלוג # PBSA0575).
- הכנס את המחט microinjection לתוך החדר forebrain ו להזריק תערובת DNA 4nl, כמו זורם נוזל אדום את הנפיחות של החדר ניתן להבחין.
- מיד, אחת 28.5 V הדופק לאורך 1 אלפית השנייה יושמה באופן ידני. ואז להפוך את הקוטביות וליישם עוד 28.5 V הדופק לאורך 1 אלפית השנייה. זה יגרום תיוג פסיפס הבילטרליים של תאים עצביים forebrain אבי.
- לאחר electroporation של 10 עוברים, מוסיפים 5 מ"ל בינוני עובריים כדי לכסות את העוברים ואת הקליפה agarose עם סכין microsurgical לשחרר את העוברים.
- העברת עוברים electroporated לצלחת טרי בינוני 30 מ"ל עובריים המכיל 0.003% PTU ו לדגור על 28.5 ° C.
4. הרכבה ו - זמן לשגות הדמיה חיה
- בסביבות 4 שעות לאחר electroporation, האות EGFP הוא הנצפה אם מתחת למיקרוסקופ לנתח epifluorescent.
- חמש שעות לאחר electroporation, בחר את העוברים עם פסיפס מאוד אך ביטוי EGFP חזק באזור המוח הקדמי.
- העברת עוברים שנבחרו בינוני עובריים המכיל 10 מ"ל PTU 0.003%.
- הוסף 420 μl tricaine מניות (4mg/ml) ועד עוברי 10ml בינוני to להרדים את העוברים.
- להר עוברים, לטבול 1 העובר ב 0.8% נקודת התכה נמוכה agarose. ואז להסיר לאלתר את העובר מן agarose עם טפטפת זכוכית במקום העובר על במרכזה של צלחת זכוכית 35mm התחתונה תרבות (MatTek תאגיד, חלק # P35GC-1.5-10-C, www.glass-bottom-dishes.com ) .
- להתמצא עוברים בעדינות עם בדיקה סיבים למצב הגבי-up לפני agarose מתמצק.
- מניחים את צלחת כראוי על הבמה טמפרטורה מבוקרת של המיקרוסקופ confocal כפי שמוצג באיור 1C (אנו משתמשים במיקרוסקופ C1 Nikon confocal ספקטרלי עם עד הימנית יעדים). כוונו את הטמפרטורה ל 28.5 ° C.
- הוסף 3ml 28.5 ° C בינוני עובריים שחומם מראש המכיל 0.003% PTU כדי לכסות את העובר. העובר מוכן כעת הדמיה.
- בצעו זמן לשגות הדמיה לחיות עם מרווח קבוע באמצעות טבילה במים אובייקטיבי.
5. נציג תוצאות
שמוצג באיור 2 נבחרות מסגרות של הדמיה זמן לשגות חי confocal של העובר electroporated של EF1α-GFF + כטב"מ-E1B-EGFP ב hpf 22.
באיור 1. Apparatus הגדרת. (א) הרכבה של ציוד electroporation: גראס SD9 מרובע ממריץ הדופק (i), micromanipulator שמאל (ii), האלקטרודות (iii), Zeiss הניתוחים מיקרוסקופ (iv), המחט להזרקת (v), את הזכות micromanipulator (vi) ו-IM Narishige microinjector 300 (ז). (ב) המיקום היחסי של אלקטרודות (i), את החדר forebrain (ii) את מחט הזריקה (iii). הערה הפתרון אדום בצבע DNA כבר מוזרק לתוך החדר forebrain. (ג) הרכבה של הדמיה לחיות מיקרוסקופ C1 Nikon confocal: בקר טמפרטורה (i), טבילה במים אובייקטיבי len (ii) את העובר electroporated מוטבע נקודת התכה נמוכה agarose בתוך צלחת תחתית תרבות זכוכית (ג) (ד ' ) תמונה של מחט משך וחותכים עבור microinjection של ה-DNA.
איור 2. תמונות נבחרות של הדמיה זמן לשגות 18 שעות לחיות confocal של העובר electroporated עם EF1α-GFF + כטב"מים-E1B-EGFP hpf ב 22. משטח החדר נמצא בצד התחתון של כל מסגרת התמונה. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את שיטת הדמיה זמן לשגות חיים של ובתאים עצביים ברמה המשובטים בקידמתו דג הזברה מתפתח. בדקנו ולשנות את הפרוטוקולים הקיימים electroporation 4-6 כדי גנטית fluorescently בודדים תווית תאים עצביים אבי. עץ היוחסין מורכב clonally התאים הצאצאים הקשורים ניתן לקבוע כי רק מספר תאים תויגו בדלילות עם מתח נמוך יחסית של electroporation. בנוסף EGFP, התאים ובתאים עצביים יכול להיות מתויג subcellularly פשוט על ידי החלפת EGFP עם סמנים ניאון אחרים עם חלבוני ניאון שונים. לדוגמה, אם EF1α-GFF היה שותף electroporated עם כטב"מ-E1B-memberane-EGFP ו-כטב"מ E1B-H2B-mRFP, ממברנות של ובתאים הפרט תסווג חלבון פלואורסצנטי ירוק תוך גרעין תסווג חלבון פלואורסצנטי אדום. רוב ובתאים שכותרתו בריאים כפי שמעידים ההתפתחות הנורמלית הכללית של העוברים electroporated ו אפופטוזיס כמה שנצפו במהלך הדמיה לחיות. זה גם קריטי להשתמש בריכוז נמוך של agarose לעלות את העובר ולהשתמש כוח לייזר מינימלי במהלך הדמיה לחיות confocal לשמור על התאים הבריאים. השיטה הנוכחית יכול להיות מיושם גם לחלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית כגון במוח האחוריות ואת חוט השדרה. עם זאת, הטכניקה הזו לא ניתן להחיל על העוברים מתחת לגיל 18 hpf, שכן בונה DNA חייב להיות מוזרק לתוך החדר עבור electroporation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי theNIH grantNS042626. אנו מודים קוץ קורט קליפורניה בסן פרנסיסקו ניקון הדמיה מרכז סיוע הדמיה.
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- G#246;tz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).
- Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos. Methods. 39, 207-211 (2006).
- Hendricks, M., Jesuthasan, S. Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development. Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).
- Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration. Genesis. 32, 27-31 (2002).
