在发展中国家斑马鱼的前脑的神经祖细胞克隆相关的定时实时成像

Summary

本视频演示了一种方法，这需要电和共聚焦显微镜相结合的优势，发展中的斑马鱼的前脑执行个别的神经祖细胞的实时成像。

Abstract

神经祖细胞的分裂，迁移和分化的精确的模式是正确的大脑^发育和功能1,2的关键。为了了解神经祖细胞在体内环境中的复杂行为，时间推移，一个完整的大脑中的神经祖细胞的实时成像是至关重要的。在这段视频中，我们利用斑马鱼胚胎的独特功能，以可视化的前脑的神经祖细胞在体内的发展。我们使用电基因和人口稀少的标签个别的神经祖细胞。简言之，构造编码荧光标记的DNA注射到受精后22小时（HPF），斑马鱼的胚胎和电脉冲，立即交付的前脑脑室。六个小时后，电穿孔的斑马鱼的胚胎被安装在玻璃底培养皿低熔点琼脂糖。荧光标记的神经祖细胞，然后成像下共聚焦显微镜使用水浸渍物镜固定的时间间隔36小时。本方法提供了一种方式来获得脑的神经祖细胞在体内发展的见解，并可以应用到中央神经系统的斑马鱼胚胎的其他部分。

Protocol

1。斑马鱼胚胎的制备

1. 前两天电，成立了野生型使用的分隔独立的男性从女性的鱼交配笼。
2. 一天前，电，拉在交配前一天的笼子的分隔。
3. 收集胚胎和孵化50个受精胚胎在30毫升胚胎含有0.003％苯基硫脲嘧啶（PTU）的媒介为28.5 ° C。
4. 在一天的电，dechorionate手动精细镊子（INOX 5，杜蒙电子，瑞士），当胚胎到达的22hpf发育阶段的胚胎。然后转移胚胎到10ml电振铃中^的 3（180毫米氯化钠，氯化钾5MM，1.8毫米氯化钙，5毫米HEPES pH值7.2），其中包含0.003％机动部队。
5. 加入420μLtricaine股票（4mg/ml）10毫升电​​林格麻醉胚胎。

2。为电穿孔的制备

1. 毛细血管（1.2毫米，0.9 mm内径，外径与长丝）上火焰山 - 布朗P897拉马（萨特仪器，诺瓦托，美国加利福尼亚州）玻璃注射针被拔出。针尖被打破用镊子来获得清晰的目的，在图1d所示。针尖的直径约10微米，并应约30度锥角。
2. 准备0.8％和1％低熔点琼脂糖（谢尔顿科学，公司目录＃IB70050）振铃电的解决方案。分装在2毫升离心管的琼脂糖溶液。保持在一个加热块〜37 ° C的等分
3. Gal4/UAS系统是用来驱动电穿孔胚胎的神经祖细胞的基因表达。用于两个质粒：质粒EF1α- GFF - PT2KXIG，其中Gal4FF是无处不在的发起人EF1α驱动，和质粒UAS - E1B - EGFP - PT2KXIG。
4. 准备EF1α- GFF - PT2KXIG和UAS - E1B - EGFP - PT2KXIG使用GenEluteTM HP质粒Midiprep试剂盒（Sigma公司）的质粒DNA。
5. 质粒是醋酸钠/乙醇沉淀，然后集中到10毫米的Tris · CL 1-2微克/μL终浓度（pH值8.5）。
6. 混合使用这两种质粒和无核酸水到终浓度为500毫微克/μL每个质粒稀释。酚红（稀释后总体积的1 / 10）是首选的解决方案交付的可视化。保持在冰上的DNA溶液。
7. 前电穿孔，回程2μl的DNA溶液注射针头和注射量调整到2 NL。

3。电穿孔

1. 一个stero解剖镜下（蔡司STEMI 2000年的50X最大放大倍率），空气压力喷油器（Narishige IM 300微量），2 micromanipulators（WPI的M3301R，世界精密仪器，萨拉索塔，佛罗里达州，美国），和电刺激（SD9方波脉冲刺激，草Tlefactor，西华威，罗得岛州，美国）成立图1A所示。
2. 将其安装在1％低熔点琼脂糖的胚胎，浸泡2胚胎。然后立即删除琼脂糖用玻璃吸管的胚胎。
3. 个别滴琼脂糖的Petri一个倒置的塑料盘盖放在胚胎。胚胎定位与光纤探头到背的位置，轻轻前琼脂糖凝固，使前脑电极和微量注射针（图1B）。胚胎必须安装在单独的琼脂糖滴。
4. 左边的显微操纵电极。琼脂糖插入电极，如图1B所示。除了用于电（金控，目录＃PBSA0575）自定义铂铱并行双极电极直径和间距500微米125微米。
5. 显微注射针插入脑脑室和注入4nl的DNA组合，如流淌的红色液体和肿胀的心室可以观察到。
6. 随即，一个28.5 V脉冲持续1毫秒手动。然后反向极性和适用于一个28.5 V脉冲持续1毫秒。这将导致脑的神经祖细胞的双边镶嵌标签。
7. 10胚胎电后，加入5ml的胚胎中期胚胎和琼脂糖用显微刀释放胚胎剥离。
8. 电穿孔胚胎转移到一个胚胎培养基30毫升的新鲜菜，含有0.003％机动部队，并培育为28.5 ° C。

4。安装和定时实时成像

1. 大约4小时后，电，EGFP的信号观察，如果啶解剖显微镜下观看。
2. 电5小时后，选择具有高度的前脑区域的马赛克，但强大的EGFP表达的胚胎。
3. 选定的胚胎转移至10ml胚胎培养基中含有0.003％机动部队。
4. 加420μLtricaine股票（4mg/ml）10ml胚胎培养基中吨Ø麻醉胚胎。
5. 要挂载的胚胎，沉浸在0.8％低熔点琼脂糖1个胚胎。然后立即删除琼脂糖胚胎用玻璃吸管和一个35mm的玻璃底培养皿放在中心（＃P35GC - 1.5 - 10 - C，MatTek公司，胚胎www.glass底dishes.com ） 。
6. 轻轻地用光纤探头前琼脂糖巩固背的位置定位的胚胎。
7. 共聚焦显微镜的温度控制阶段的菜放在正确，如在图1C（我们使用了正确的目标的尼康C1光谱共聚焦显微镜）所示。调整温度为28.5 ° C。
8. 新增3毫升28.5 ° C预热胚胎培养基中含有0.003％的机动部队，以应付胚胎。胚胎是现在准备成像。
9. 执行使用水浸渍目标以固定的间隔时间推移的实时成像。

5。代表性的成果

如图2所示，选择一个时间推移，焦，电穿孔在22 HPFEF1α- GFF +无人机E1B - EGFP胚胎的实时成像帧。

图1。仪器设置。 （一）电设备的组装：草SD9平方米脉冲刺激（I），左显微操纵器（II），电极（三），（四），蔡司解剖显微镜的注射针（V），正确的显微（vi）及Narishige IM 300微量（七）。 （二）电极（I），前脑脑室（ii）及注射针（三）的相对位置。注意红色的DNA溶液注射入脑脑室。 （三）大会尼康C1的共聚焦显微镜实时成像：温度控制器（I），水浸渍客观LEN（ii）及电穿孔胚胎在低熔点琼脂糖中嵌入一个玻璃底培养皿（三）（四一个拉和切割针注射的DNA）图像。

图2选择18小时的时间推移，焦，电穿孔与EF1α- GFF +无人机E1B - EGFP在22 HPF胚胎实时成像的框架。心室表面是对每帧图像的底部。比例尺代表10微米。

Discussion

在这段视频中，我们展示了一个时间推移在一个发展中的斑马鱼的前脑的克隆水平的神经祖细胞的实时成像的方法。我们测试和修改现有的电^协议 4-6的基因和荧光标签个别的神经祖细胞。因为只有少数细胞地广人稀一个相对的低电压电标记，克隆相关的子代细胞组成，可以建立一个谱系树。除了EGFP的，神经祖细胞可以subcellularly各种荧光蛋白标记，只需更换与其他荧光标记的EGFP。例如，如果EF1α- GFF合作与UAS - E1B - memberane - EGFP和UAS - E1B - H2B - MRFP电穿孔，个别祖细胞的细胞膜会被贴上绿色荧光蛋白而将红色荧光蛋白标记细胞核。大多数标记祖细胞是健康的，由一般的电穿孔胚胎，并在实时成像观察到几个凋亡的正常发展。同样重要的是，使用低浓度的琼脂糖装入的胚胎，并使用一个最小的激光功率在现场共聚焦成像技术来保持细胞健康。目前的技术还可以应用于如后大脑和脊髓的中央神经系统的其他部分。然而，这种技术不能适用于对胚胎比18 HPF岁的年轻人，因为要注入到心室电的DNA结构。