Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Summary

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Abstract

Bölünme, göç ve nöral progenitör hücrelerin farklılaşma hassas kalıpları, uygun bir beyin gelişimi ^ve işlevi 1,2 için çok önemlidir. In vivo ortamda karmaşık nöral progenitör hücrelerin davranışını anlamak için, sağlam bir beyin nöral progenitör hücrelerin zaman atlamalı canlı görüntüleme eleştirel gereklidir . Bu video, in vivo önbeyin nöral progenitör hücrelerin gelişimini görselleştirmek için zebrafish embriyoların benzersiz özellikleri istifade eder. Biz genetik ve seyrek etiket bireysel nöral progenitör hücrelerin elektroporasyon kullanın. Kısacası, DNA floresan belirteçler için kodlama yapıları, 22 saat sonra döllenme (hpf) zebrafish embriyolar ve elektrik bakliyat hemen teslim edildi önbeyin ventrikül içine enjekte edildi. Altı saat sonra, electroporated zebrafish embriyoların cam alt kültür yemekleri, düşük erime noktası agaroz ile monte edilmiştir. Floresan ile işaretlenmiş nöral progenitör hücreler daha sonra suya daldırma objektif lens kullanarak konfokal mikroskop altında sabit aralıklarla 36hours için görüntülenmiştir. Bu yöntemi, ön beyin nöral progenitör hücrelerin in vivo gelişiminde içgörüler kazanmak için bir yol sağlar ve Zebra balığı embriyonun merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde uygulanabilir .

Protocol

1. Zebra balığı Embriyolar hazırlanması

1. Elektroporasyon İki gün önce, çiftleşme kafesleri ayrı kadınlarda erkeklere bölücüler kullanarak vahşi tip balık kurdu.
2. Elektroporasyon bir gün önce, önceki günden itibaren kafeslerde çiftleşme bölücüler çekin.
3. Embriyolar toplayın ve 28.5% 0.003 phenylthiourea (PTU) içeren 30 ml embriyonik orta ° C 50 döllenmiş embriyolar inkübe
4. Elektroporasyon gününde, dechorionate elle embriyoların 22hpf gelişimsel aşaması ulaşmak ince forseps (Inox 5, Dumont Elektronik, İsviçre) ile embriyoların. Sonra PTU% 0.003 içeren 10ml elektroporasyon ringer ³ (180 mM NaCl, 5mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2) embriyolar transfer.
5. Zil sesi embriyoların uyutmak için 10ml elektroporasyon 420 ul tricaine stoku (4mg/ml) ekleyin.

2. Elektroporasyon için hazırlanması

1. Cam enjeksiyon iğneleri Flaming-Brown P897 çektirmesi (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) kılcal damarlar (filament 1.2 mm OD, 0.9 mm ID) çekilmiştir. Rakam 1D gösterildiği gibi iğne ucu keskin bir ucu almak için forseps ile kırıldı. Ucunun çapı yaklaşık 10 mikron olmalı ve konik açısı 30 derece civarında olmalıdır.
2. % 0.8 'hazırlayın ve elektroporasyon ringer solüsyonu% 1 düşük erime noktası agaroz (Shelton Scientific, Inc. Katalog # IB70050). Kısım 2 ml mikrosantrifüj tüpler agaroz çözüm. ~ 37 ° C'de ısı bloğu alikotları tutun
3. Gal4/UAS sistemi, electroporated embriyoların nöral progenitör hücrelerin gen ekspresyonu sürücü kullanılır. İki plazmid kullanılır: Gal4FF her yerde organizatörü EF1α tarafından tahrik edildiği plazmid EF1α GFF-PT2KXIG, ve plazmid UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG.
4. EF1α-GFF-PT2KXIG ve UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG plazmid DNA GenEluteTM HP Plazmid Midiprep Kiti (Sigma) kullanarak hazırlayın.
5. Plazmid sonra 1-2 mg / ml 10 mM Tris · Cl final konsantrasyonu (pH 8.5) sodyum asetat / etanol yağış yoğunlaşmıştır.
6. Iki plazmid karıştırın ve her plazmid için 500 ng / ml bir final konsantrasyon nükleaz ücretsiz H2O ile seyreltilir. Çözümü için fenol kırmızısı (1 / 10 toplam hacmi seyreltilmiş) eklenmesi teslimat görünüm için tercih edilir. DNA çözümü buz üzerinde tutun.
7. 2 ul DNA çözümü ile elektroporasyon, backload bir iğne sağ öncesi ve enjeksiyon hacmi 2 nl ayarlayabilirsiniz.

3. Elektroporasyon

1. A Stero diseksiyon mikroskobu (Zeiss 50x maksimum büyütme STEMI 2000), bir hava basıncı enjektör (Narishige IM 300 mikroenjektör), iki mikromanipülatörler (TEFE M3301R, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, ABD), ve elektrik stimülatörü (SD9 Şekil 1A gösterildiği gibi kare dalga Stimülatörü, Çim Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, ABD) kurulur.
2. % 1 düşük erime noktası agaroz embriyolar batırmayın 2 embriyolar monte etmek için. Sonra hemen bir cam pipet ile agaroz embriyolar kaldırmak.
3. Embriyolar agaroz bireysel damla ters bir plastik Petri kabı kapağının üzerine koyun. Agaroz önbeyin elektrotlar ve mikroenjeksiyon iğnesi (Şekil 1B) erişilebilir olduğunu katılaşır önce lifli bir prob ile dorsal pozisyonda yavaşça embriyolar yolunuzu. Embriyolar bireysel agaroz damla monte edilmelidir.
4. Sol mikromanipülatör ile elektrotlar işleyin. Agaroz içine elektrotlar Şekil 1B gösterildiği gibi yerleştirin. Özel platin iridyum 125 mm çap ve 500 mm aralıklı paralel bipolar elektrotlar dışında elektroporasyon (FHC, katalog # PBSA0575) için kullanılır.
5. Kırmızı sıvı akan ve ventrikül şişme görülebilir, ön beyin ventrikül içine mikroenjeksiyon iğnesi takın ve 4NL DNA karışımı enjekte edilir.
6. Hemen bir 28.5 V darbe ömürlü 1 milisaniyelik elle uygulandı. Sonra ters polarite ve birden fazla 28.5 V darbe kalıcı 1 milisaniye geçerlidir. Bu ikili mozaik etiketleme önbeyin nöral progenitör hücrelerin neden olacaktır.
7. 10 embriyoların elektroporasyon sonra, embriyolar serbest bırakmak için bir mikrocerrahi bıçakla embriyolar kapak ve agaroz soyma 5ml embriyonik orta ekleyin.
8. 28,5 az% 0.003 PTU ve inkübe içeren 30 ml embriyonik orta taze bir çanağı ° C electroporated embriyolar transfer

4. Montaj ve zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

1. Elektroporasyon sonra yaklaşık 4 saat, eğer bir epifluorescent diseksiyon mikroskobu altında incelendi EGFP sinyal gözlemlenebilir.
2. Elektroporasyon beş saat sonra, son derece mozaik değil, ön beyin bölgede güçlü EGFP ifade ile embriyolar seçin.
3. % 0.003 PTU içeren 10ml embriyonik orta seçilen embriyolar transfer.
4. 10ml embriyonik orta t 420 ul tricaine stoku (4mg/ml)o embriyoların uyutmak.
5. Embriyoların monte etmek için,% 0.8 düşük erime noktası agaroz 1 embriyo batırmayın. Sonra hemen bir cam pipet ile agaroz embriyo kaldırmak ve 35mm cam alt kültür çanak merkezi (Mattek şirketi, Part # P35GC-1.5-10-C, embriyo www.glass-alt-dishes.com ) .
6. Agaroz katılaşır önce dorsal-yukarı konumda lifli bir prob hafifçe embriyolar yolunuzu.
7. Konfokal mikroskop sıcaklık kontrollü sahnede çanak düzgün şekil 1C (sağ-üst hedefleri ile Nikon C1 spektral konfokal mikroskop kullanımı) gösterildiği gibi yerleştirin. 28.5 için sıcaklığını ayarlamak ° C
8. Ekle 3ml 28.5 ° C embriyo kapsayacak şekilde PTU% 0.003 içeren embriyonik önceden ısıtılmış orta. Embriyo artık görüntüleme için hazırdır.
9. Su daldırma amacı kullanarak sabit bir aralığı ile zaman atlamalı canlı görüntüleme gerçekleştirin.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 2'de gösterildiği gibi 22 hpf EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP electroporated embriyonun bir zaman atlamalı konfokal canlı görüntüleme kare seçilir.

Şekil 1. Aparatı set-up. (A) elektroporasyon ekipmanların montaj: Çim SD9 kare dalga Stimülatörü (i), (ii) sol mikromanipülatör, elektrotlar (iii), (iv), (v) bir iğne, sağ mikromanipülatör Zeiss diseksiyon mikroskobu (vi) ve Narishige IM 300 mikroenjektör (vii). (B) elektrotlar (i), ön beyin ventrikül (ii) ve enjeksiyon iğnesi (iii) göreli konumunu. Kırmızı renkli DNA çözüm, ön beyin ventrikül içine enjekte edilmiştir. (C) Nikon C1 konfokal mikroskop canlı görüntüleme montaj: sıcaklık kontrolörü (i) su objektif len (ii) ve cam bir alt kültür çanak (iii) (D düşük erime noktası agaroz gömülü electroporated embriyo daldırma DNA mikroenjeksiyon için çekti ve kesilmiş iğne).

Şekil 2 22 hpf EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP electroporated embriyonun 18 saatlik zaman atlamalı konfokal canlı görüntüleme Seçilmiş kareleri. Ventrikül yüzeyi her görüntü çerçevesinin alt tarafta. Ölçek çubuğu 10 mm temsil eder.

Discussion

Bu video, zaman atlamalı, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bir klonal düzeyde nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz genetik ve floresan etiket bireysel nöral progenitör hücrelerin test edilmiş ve mevcut elektroporasyon protokolleri ^4-6 değiştirilmiş. Klonal olarak ilişkilidir döl hücrelerinin oluşan bir soy ağacı sadece birkaç hücre seyrek elektroporasyon göreceli düşük voltaj ile etiketlenmiş beri kurulabilir. EGFP ek olarak, nöral progenitör hücreleri subcellularly sadece diğer floresan işaretleri ile EGFP değiştirerek çeşitli floresan proteinleri ile etiketli olabilir. EF1α GFF UAS-E1B memberane-EGFP ve UAS-E1B-H2B-MRFP birlikte electroporated ise çekirdeği kırmızı floresan proteini ile etiketlenmiş olacaktır Örneğin, bireysel progenitör hücrelerin membranları yeşil flüoresan protein ile etiketlenmiş olacaktır. Etiketli progenitör hücreler, canlı görüntüleme sırasında gözlenen electroporated embriyo ve birkaç apoptozis genel normal gelişimi ile kanıtlandığı gibi çoğu sağlıklı. Aynı zamanda düşük konsantrasyonda agaroz bir embriyo montaj ve sağlıklı tutmak için hücreler konfokal canlı görüntüleme sırasında en az bir lazer gücü kullanmak kullanmak için kritik öneme sahiptir. Mevcut teknik, arka beyin ve omurilik gibi merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde de uygulanabilir. DNA yapıları elektroporasyon için ventrikül içine enjekte edilir beri Ancak, bu tekniğin, daha genç 18 hpf embriyonlar üzerinde uygulanabilir değildir.