Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Summary

Il video presente mostra un metodo che sfrutta la combinazione di elettroporazione e microscopia confocale per eseguire l'imaging in diretta su singole cellule progenitrici neurali nel proencefalo zebrafish via di sviluppo.

Abstract

Schemi precisi di divisione, migrazione e differenziazione delle cellule progenitrici neurali sono cruciali per il corretto sviluppo del cervello e ^1,2 funzione. Per capire il comportamento delle cellule progenitrici neurali nel complesso in un ambiente vivo, time-lapse immagini dal vivo delle cellule progenitrici neurali in un cervello intatto è criticamente necessaria. In questo video, sfruttiamo le caratteristiche uniche di embrioni di zebrafish per visualizzare lo sviluppo delle cellule progenitrici neurali proencefalo in vivo. Noi usiamo per elettroporazione geneticamente e scarsamente etichetta singole cellule progenitrici neurali. In breve, il DNA che codifica per i costrutti marcatori fluorescenti sono stati iniettati nel ventricolo proencefalo di 22 ore dopo la fecondazione (HPF) embrioni di zebrafish e impulsi elettrici sono stati consegnati immediatamente. Sei ore più tardi, gli embrioni di zebrafish elettroporate sono stati montati con agarosio a basso punto di fusione in fondo la cultura piatti di vetro. Fluorescente cellule progenitrici neurali sono state poi ripreso per 36 ore con intervalli fissi al microscopio confocale utilizzando lenti dell'obiettivo acqua immersione. L'attuale metodo fornisce un modo per acquisire conoscenze nel vivo nello sviluppo delle cellule progenitrici neurali proencefalo e può essere applicato ad altre parti del sistema nervoso centrale dell'embrione zebrafish.

Protocol

1. Preparazione di embrioni di zebrafish

1. Due giorni prima elettroporazione, istituito gabbie di accoppiamento dei pesci di tipo selvatico con divisori per separare i maschi dalle femmine.
2. Un giorno prima elettroporazione, tirare i divisori in accoppiamento gabbie a partire dal giorno precedente.
3. Raccogliere embrioni e incubare 50 embrioni fecondati in 30 ml di mezzo embrionale contenente 0,003% phenylthiourea (PTU) a 28.5 ° C.
4. Il giorno della elettroporazione, dechorionate gli embrioni manualmente con una pinza sottile (Inox 5, Dumont elettronico, Svizzera), quando gli embrioni raggiungono lo stadio di sviluppo di 22hpf. Poi il trasferimento degli embrioni a ³ 10ml elettroporazione Ringer (180 mM NaCl, KCl 5mM, 1.8 mM CaCl2, 5 mM pH Hepes 7,2) contenente 0,003% PTU.
5. Aggiungere 420 microlitri tricaine stock (4mg/ml) per l'elettroporazione 10ml suoneria per anestetizzare gli embrioni.

2. Preparazione per elettroporazione

1. Aghi da iniezione di vetro sono stati estratti dai capillari (1,2 mm di diametro, 0,9 mm ID, con filamento) su un Flaming-Brown P897 estrattore (Sutter Instruments, Novato, CA, USA). La punta dell'ago è stata interrotta con una pinza per ottenere un fine tagliente come mostrato nella figura 1D. Il diametro della punta dovrebbe essere di circa 10 micron e l'angolo di rastremazione dovrebbe essere di circa 30 gradi.
2. Preparare 0,8% e 1% a basso punto di fusione agarosio (Shelton Scientific, Inc. catalogo # IB70050) in soluzione di Ringer elettroporazione. Aliquota della soluzione di agarosio in tubi di ml 2 microcentrifuga. Mantenere le aliquote in un blocco di calore a ~ 37 ° C.
3. Il sistema Gal4/UAS è usato per guidare l'espressione genica nelle cellule progenitrici neurali di embrioni elettroporate. Due plasmidi sono utilizzati: plasmide EF1α-GFF-PT2KXIG, in cui è guidato Gal4FF dal EF1α promotore onnipresente, e plasmide UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG.
4. Preparare EF1α-GFF-PT2KXIG e UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG DNA plasmidico utilizzando GenEluteTM HP plasmidi Midiprep Kit (Sigma).
5. I plasmidi vengono poi concentrati da sodio acetato / etanolo precipitazione alla concentrazione finale di 1-2 mg / mL in 10 mM Tris Cl ¯ (PH 8,5).
6. Mescolare le due plasmidi e diluire con nucleasi-free H2O ad una concentrazione finale di 500 ng / mL per ogni plasmide. L'aggiunta di rosso fenolo (diluito volume totale 1 / 10) per la soluzione è preferita per la visualizzazione di consegna. Tenere la soluzione di DNA su ghiaccio.
7. Poco prima elettroporazione, ritardare l'ago per l'iniezione con 2 microlitri soluzione di DNA e regolare il volume di iniezione a 2 nl.

3. Elettroporazione

1. Un microscopio a dissezione stero (Zeiss Stemi 2000 con un ingrandimento massimo di 50x), una pressione di iniezione (Narishige IM 300 microinjector), due micromanipolatori (WPI M3301R, strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, USA), e uno stimolatore elettrico (SD9 piazza impulso stimolatore, Erba Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) sono impostati come mostrato nella Figura 1A.
2. Per montare gli embrioni, immergere 2 embrioni di 1% a basso punto di fusione agarosio. Poi rimuovere immediatamente gli embrioni dal agarosio con una pipetta di vetro.
3. Mettere gli embrioni in un coperchio di plastica rovesciata piastra Petri in singole gocce di agarosio. Orientare gli embrioni delicatamente con una sonda ad una dorsale in fibra-up prima posizione l'agarosio si solidifica in modo che il prosencefalo è accessibile sia per gli elettrodi e l'ago microiniezione (Figura 1B). Gli embrioni devono essere montate nei singoli agarosio gocce.
4. Manipolare gli elettrodi con il micromanipolatore sinistra. Inserire gli elettrodi nella agarosio come mostrato nella Figura 1B. Personalizzati platino iridio elettrodi bipolari parallelo 125 micron di diametro e distanziati 500 micron a parte sono utilizzati per l'elettroporazione (FHC, catalogo PBSA0575).
5. Inserire l'ago microiniezione nel ventricolo proencefalo e iniettare mix 4NL DNA, come fluire di liquido rosso e il gonfiore del ventricolo può essere osservato.
6. Immediatamente, una 28,5 V impulso della durata di 1 millisecondo è stato applicato manualmente. Poi invertire la polarità e applicare un altro 28,5 V impulso della durata di 1 millisecondo. Questo si tradurrà in etichettatura mosaico bilaterale del proencefalo cellule progenitrici neurali.
7. Dopo l'elettroporazione di 10 embrioni, aggiungere 5 ml di media embrionale per coprire gli embrioni e la buccia di agarosio con un coltello microchirurgica per liberare gli embrioni.
8. Trasferire gli embrioni elettroporate per un piatto fresco di 30 ml di mezzo embrionale contenente 0,003% PTU e incubare a 28.5 ° C.

4. Montaggio e Time-lapse dell'immagine in tempo reale

1. Circa 4 ore dopo l'elettroporazione, il segnale EGFP è osservabile se osservato al microscopio epifluorescente dissezione.
2. Cinque ore dopo l'elettroporazione, selezionare gli embrioni con il mosaico, ma espressione di EGFP molto forte nella regione proencefalo.
3. Trasferire gli embrioni selezionati per media 10ml embrionale contenente 0,003% PTU.
4. Aggiungere 420 microlitri tricaine stock (4mg/ml) al embrionale 10ml medio to anestetizzare gli embrioni.
5. Per montare gli embrioni, immergere 1 embrione nello 0,8% di agarosio a basso punto di fusione. Poi rimuovere immediatamente l'embrione dal agarosio con una pipetta di vetro e posto l'embrione al centro di un piatto di 35 millimetri cultura fondo di vetro (MatTek società, parte # P35GC-1.5-10-C, www.glass-bottom-dishes.com ) .
6. Orientare gli embrioni delicatamente con una sonda ad una dorsale in fibra-up prima posizione l'agarosio si solidifica.
7. Porre la capsula correttamente sul palcoscenico temperatura controllata del microscopio confocale come mostrato in figura 1C (Usiamo una Nikon C1 microscopio confocale spettrale con in alto a destra obiettivi). Regolare la temperatura a 28,5 ° C.
8. Aggiungere 3 ml 28,5 ° C preriscaldato medio embrionale contenente 0,003% PTU per coprire l'embrione. L'embrione è ora pronto per l'imaging.
9. Eseguire time-lapse imaging dal vivo con un intervallo fisso con un obiettivo d'acqua ad immersione.

5. Rappresentante Risultati

Mostrato nella Figura 2 sono selezionati fotogrammi di un time-lapse confocale vivo dell'embrione elettroporate di EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP a 22 HPF.

Figura 1. Apparatus set-up. (A) L'assemblea di attrezzature elettroporazione: l'erba SD9 piazza impulso stimolatore (i), la micromanipolatore sinistra (ii), gli elettrodi (iii), la dissezione microscopio Zeiss (iv), l'ago di iniezione (v), il micromanipolatore destra (vi) e la Narishige IM 300 microinjector (vii). (B) La posizione relativa degli elettrodi (i), il ventricolo proencefalo (ii) e l'ago per iniezione (iii). Notare il colore rosso soluzione di DNA è stato iniettato nel ventricolo proencefalo. (C) Il montaggio delle immagini in diretta su microscopio confocale Nikon C1: il regolatore di temperatura (i), l'acqua immergendo obiettivo len (ii) e l'embrione elettroporate incorporato in agarosio a basso punto di fusione in un piatto di cultura fondo di vetro (iii) (D ) Immagine di un ago tirato e tagliato per microiniezione di DNA.

Figura 2. Fotogrammi selezionati di 18 ore di time-lapse confocale vivo dell'embrione elettroporate con EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP a 22 HPF. Superficie ventricolo si trova sul lato inferiore di ogni telaio immagine. Barra di scala rappresenta 10 micron.

Discussion

In questo video, si dimostra un metodo per time-lapse immagini dal vivo di cellule progenitrici neurali a livello clonale nel proencefalo zebrafish via di sviluppo. Abbiamo testato e modificato i protocolli esistenti elettroporazione ^4-6 a geneticamente e fluorescente etichetta singole cellule progenitrici neurali. Un albero lignaggio composto da cellule progenie clonale relativi possono essere stabiliti dal momento che solo poche cellule sono state scarsamente etichettati con un voltaggio relativamente basso di elettroporazione. Oltre alla EGFP, le cellule progenitrici neurali possono essere etichettati con vari subcellularly proteine ​​fluorescenti con la semplice sostituzione EGFP con altri marcatori fluorescenti. Per esempio, se EF1α-GFF è stato co-elettroporate con UAS-E1B-memberane-EGFP e UAS-E1B-H2B-MRFP, le membrane delle cellule progenitrici individuo sarà marcato con una proteina fluorescente verde, mentre il nucleo sarà etichettato con il rosso proteina fluorescente. La maggior parte delle cellule progenitrici etichettati sono in buona salute come dimostra il normale sviluppo generale degli embrioni elettroporate e apoptosi pochi osservato durante l'imaging dal vivo. E 'inoltre fondamentale utilizzare una bassa concentrazione di agarosio per montare l'embrione e usare una potenza minima di imaging confocale laser durante vivere per mantenere le cellule sane. La tecnica attuale può essere applicato anche ad altre parti del sistema nervoso centrale come il cervello posteriore e il midollo spinale. Tuttavia, questa tecnica non può essere applicata a embrioni con meno di 18 HPF, dal momento che i costrutti del DNA deve essere iniettato nel ventricolo per l'elettroporazione.