Time-lapse Live avbildning av kloner som är närbesläktade neurala stamceller i utvecklingsländerna Zebrafish framhjärnan

Summary

Den nuvarande videon demonstrerar en metod som drar nytta av kombinationen av elektroporation och konfokalmikroskopi att utföra Bildproduktion på enskilda neurala stamceller i utvecklingsländerna zebrafisk framhjärnan.

Abstract

Exakt mönster av splittring, migration och differentiering av neurala stamceller är avgörande för korrekt hjärnans utveckling och funktion ^1,2. För att förstå beteendet hos neurala stamceller i komplex in vivo miljö är tidsförlopp leva avbildning av neurala stamceller i en intakt hjärna kritiskt krävs. I denna video, utnyttja vi de unika egenskaperna hos zebrafisk embryon för att visualisera utvecklingen av framhjärnan neurala stamceller in vivo. Vi använder elektroporation till genetiskt och glest etikett enskilda neurala stamceller. Kortfattat bygger DNA som kodar för fluorescerande markörer var injiceras i framhjärnan kammare 22 timmar efter befruktning (HPF) zebrafisk embryon och elektriska pulser levererades omedelbart. Sex timmar senare var electroporated zebrafisk embryon monteras med låg smältpunkt agaros i glas rätter botten kultur. Fluorescerande neurala stamceller har sedan avbildade för 36hours med jämna mellanrum under ett konfokalmikroskop med vatten att doppa objektiv. Denna metod ger ett sätt att få insikt i in vivo utvecklingen av framhjärnan neurala stamceller och kan tillämpas på andra delar av centrala nervsystemet i zebrafisk embryot.

Protocol

1. Beredning av Zebrafish embryon

1. Två dagar innan elektroporation, inrätta parning burar av vild typ fiskar med avdelare för att skilja hanar från honor.
2. En dag innan elektroporation, dra avdelare i parningen burar från föregående dag.
3. Samla embryon och inkubera 50 befruktade embryon i 30 ml embryonala medium som innehåller 0,003% phenylthiourea (PTU) vid 28,5 ° C.
4. På dagen av elektroporation, dechorionate embryona manuellt med fin pincett (Inox 5, Dumont Electronic, Schweiz) när embryona når utvecklingsstadiet av 22hpf. Sedan överföra de embryon som 10ml elektroporation Ringers ³ (180 mM NaCl, 5mm KCl, 1,8 mm CaCl2, 5 mm Hepes pH 7,2) innehåller 0,003% PTU.
5. Tillsätt 420 l tricaine lager (4mg/ml) till 10ml elektroporation Ringers att söva embryona.

2. Förberedelse för elektroporation

1. Glas injektionsnålar drogs från kapillärer (1,2 mm YD, 0,9 mm innerdiameter, med glödlampa) på en Flammande-Brown P897 avdragare (Sutter Instrument, Novato, CA, USA). Nålspetsen bröts bort med pincett för att få en skarp slut enligt figur 1D. Diametern på spetsen bör vara cirka 10 mikrometer och Konvinkeln bör ligga runt 30 grader.
2. Förbered 0,8% och 1% med låg smältpunkt Agar (Shelton Scientific, Inc. katalog # IB70050) i elektroporering Ringers lösning. Alikvotera den agaroslösningen i 2 tuber ml mikrocentrifug. Håll delprover i ett värmeblock vid ~ 37 ° C.
3. Det Gal4/UAS Systemet används för att driva genuttryck i neurala stamceller i electroporated embryon. Två plasmider används: plasmid EF1α-GFF-PT2KXIG, där Gal4FF drivs av den allestädes närvarande initiativtagaren EF1α och plasmid UAS-E1b-EGFP-PT2KXIG.
4. Förbered EF1α-GFF-PT2KXIG och UAS-E1b-EGFP-PT2KXIG plasmid-DNA med GenEluteTM HP Plasmid Midiprep Kit (Sigma).
5. Den plasmider sedan koncentreras genom natriumacetat / etanol nederbörd till den slutliga koncentrationen på 1-2 mikrogram / l i 10 mM Tris · Cl (PH 8,5).
6. Blanda de två plasmider och späd med nukleasfritt H2O till en slutlig koncentration av 500 ng / l för varje plasmid. Tillägg av fenol rött (utspädd 1 / 10 total volym) för att lösningen är att föredra för visualisering av leverans. Håll DNA lösningen på is.
7. Precis innan elektroporation, skjuta upp den injektionsnålen med 2 l DNA-lösning och justera injektion volymen till 2 NL.

3. Elektroporation

1. En stero dissektion mikroskop (Zeiss STEMI 2000 med en maximal förstoring 50x), ett lufttryck injektor (Narishige IM 300 microinjector), två micromanipulators (WPI M3301R, World precisionsinstrument, Sarasota, FL, USA), och en elektrisk stimulator (SD9 fyrkantig puls stimulator, Gräs Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) sätts upp enligt figur 1A.
2. För att montera embryon, sänk 2 embryon i 1% låg smältpunkt agaros. Sedan omedelbart bort embryon från agaros med ett glas pipett.
3. Placera embryon på en inverterad plast petriskål lock i enskilda droppar agaros. Orientera embryon försiktigt med en fiber sond till en rygg upp läget innan agarosen stelnar så att framhjärnan är tillgänglig för både elektroderna och mikroinjektion nål (Figur 1B). Embryon skall monteras i enskilda agaros droppar.
4. Manipulera elektroderna med vänster mikromanipulator. Sätt in elektroder i agaros som visas i figur 1B. Anpassad platina iridium parallellt bipolära elektroder 125 mikrometer i diameter och placerade 500 ìm förutom används för elektroporation (FHC, katalog # PBSA0575).
5. Sätt mikroinjektion nålen i framhjärnan ventrikeln och injicera 4nl DNA-mix, som flödar av röd vätska och svullnad i ventrikeln kan observeras.
6. Omedelbart var en 28,5 V puls varar 1 millisekund tillämpas manuellt. Sen omvänd polaritet och tillämpa en mer 28,5 V puls varar 1 millisekund. Detta kommer att resultera i bilaterala mosaik märkning av framhjärnan neurala stamceller.
7. Efter elektroporation av 10 embryon, tillsätt 5ml embryonala medel för att täcka embryon och skala agaros med en mikrokirurgisk kniv för att frigöra embryon.
8. Överför electroporated embryon till en ny maträtt på 30 ml embryonala medium som innehåller 0,003% PTU och inkubera vid 28,5 ° C.

4. Montering och Time-lapse Bildproduktion

1. Cirka 4 timmar efter elektroporation är EGFP signalen observerbara om ses under en epifluorescent dissekera mikroskop.
2. Fem timmar efter elektroporation, välj embryon med mycket mosaik men stark EGFP uttryck i framhjärnan regionen.
3. Överför valda embryon till 10ml embryonala medium som innehåller 0,003% PTU.
4. Tillsätt 420 l tricaine lager (4mg/ml) till 10ml embryonala medelstora to söva embryona.
5. För att montera embryon, sänk ett embryo i 0,8% låg smältpunkt agaros. Sedan omedelbart ta bort ett embryo ur agaros med ett glas pipett och placera embryot i mitten av en 35mm glas botten kultur skålen (Mattek Corporation, art.nummer P35GC-1.5-10-C, www.glass-botten-dishes.com ) .
6. Orientera embryon försiktigt med en fiber sond till en rygg upp läget innan agarosen stelnar.
7. Placera skålen ordentligt på temperaturkontrollerade skede av konfokalmikroskop som visas i figur 1C (Vi använder en Nikon C1 spektral konfokalmikroskop med upp till höger mål). Justera temperaturen till 28,5 ° C.
8. Tillsätt 3 ml 28,5 ° C förvärms embryonala medium som innehåller 0,003% PTU att täcka embryot. Embryot är nu klar för avbildning.
9. Utför tidsförlopp leva avbildning med ett fast intervall med en vatten doppa mål.

5. Representativa resultat

Visas i figur 2 är utvalda bilder av ett tidsförlopp konfokala Bildproduktion av embryot electroporated av EF1α-GFF + UAS-E1b-EGFP vid 22 HPF.

Figur 1. Apparatur uppsättning. (A) Monteringen av elektroporation utrustning: gräset SD9 torget puls stimulator (i), den vänstra mikromanipulator (ii), elektroderna (III), Zeiss dissekera mikroskop (iv), den injektionsnål (v), rätten mikromanipulator (vi) och Narishige IM 300 microinjector (vii). (B) Den relativa position elektroder (I), framhjärnan kammare (II) och injektionsnål (iii). Notera den rödfärgade DNA lösningen har injicerats i framhjärnan ventrikeln. (C) Monteringen av levande avbildning på Nikon C1 konfokalmikroskop: temperatur regulator (i), vattnet doppade målet len ​​(ii) och electroporated embryot inbäddade i låg smältpunkt agaros i ett glas botten kultur skål (III) (D ) Bild av en drog och skär nål för mikroinjektion av DNA.

Figur 2. Valda bilder på en 18-timmars tidsintervaller konfokala Bildproduktion av embryot electroporated med EF1α-GFF + UAS-E1b-EGFP vid 22 HPF. Ventrikeln ytan är på undersidan av varje bild ram. Skala stapel representerar 10 mikrometer.

Discussion

I denna video visar vi en metod för tidsförlopp leva avbildning av neurala stamceller till en klonal nivå i utvecklingsländerna zebrafisk framhjärnan. Vi testade och ändrade den befintliga elektroporation protokollen ^4-6 till genetiskt och fluorescerande etikett enskilda neurala stamceller. En härstamning träd består av kloner relaterade avkomma celler kan fastställas eftersom endast ett fåtal celler var glest märkt med en relativt låg spänning på elektroporation. Förutom EGFP kan neurala stamceller kan subcellularly märkta med olika fluorescerande proteiner genom att helt enkelt byta ut EGFP med andra fluorescerande markörer. Till exempel, om EF1α-GFF var co-electroporated med UAS-E1b-memberane-EGFP och UAS-E1b-H2B-mRFP kommer membran av enskilda stamceller vara märkta med grönt fluorescerande proteinet, medan kärnan kommer att märkas med röd fluorescerande protein. De flesta av de märkta stamceller är friska vilket framgår av den allmänna normal utveckling av electroporated embryon och få apoptos observerats vid live-avbildning. Det är också viktigt att använda en låg koncentration av agaros att montera ett embryo och använder en minimal lasereffekt under konfokala Bildproduktion för att hålla cellerna friska. Den nuvarande tekniken kan även användas till andra delar av centrala nervsystemet som hind hjärnan och ryggmärgen. Kan dock denna teknik inte tillämpas på embryon yngre än 18 HPF, eftersom DNA-konstruktioner måste injiceras i ventrikeln för elektroporation.