Application Notes

초임계 유체 크로마 토그래피를 사용하여 정제를위한 기본 원칙 - 광고

Released: November 11, 2010 doi: 10.3791/2604

Jo-Ann M. Jablonski¹, Christopher J. Hudalla¹, Kenneth J. Fountain¹, Steven M. Collier¹, Damian Morrison¹

¹Chemistry Commercial Operations, Waters Corporation

Summary

초임계 유체 크로마 토그래피 (SFC)를 사용하여 혼합에서 화합물의 분리에 대한 기본 원칙은 예비 액체 크로마 토그래피의 기본과 비슷합니다.

Abstract

초임계 유체 크로마 토그래피 (SFC)는 새로운 기술은 아니지만, 예비 SFC는 계측, 소프트웨어 및 화학의 발전과 함께 점점 더 인기를 끌고있다. SFC와 화합물을 분리를위한 기본 원칙은 대규모 예비 액체 크로마 토그래피에 대한 기본 규칙과 비슷합니다. 본 연구에서는, 우리는 유량, 용매 샘플 해산 및 혼합물에서 혼합물의 분리에 대한 열 선택도의 효과를 보여줍니다. 최적 침대 밀도 (OBD) 기술 ^1과 일치 화학 모여 열 큰 예비 분리에있는 작은 규모에서 간단하고 예측 가능한 확장성을 보장합니다.

Protocol

1. 샘플 준비

컴파 운드 혼합 1 : Coumarin, 이부 프로펜, 그리고 Carbamazepine, 20 MG / ML 메탄올 각
컴파 운드 혼합 2 : 이부 프로펜과 Carbamazepine, 메탄올의 각 MG / ML 20
컴파 운드 혼합 3 : 이부 프로펜과 Carbamazepine, (디메틸 sulfoxide) DMSO의 각 MG / ML 20
컴파 운드 혼합 4 : 10 MG / ML Fenoprofen, 15 MG / ML 케토프로펜, 20 MG / ML Flavone, 20 MG / ML의 이부 프로펜, 그리고 메탄올 20 MG / ML Coumarin

2. 실험 조건

분석 크로마 토그래피는 워터스 방법 역 SFC 시스템에서 수행되었다.
칼럼 : Viridis SFC 2 - Ethylpyridine 칼럼, 5 μm의, 4.6 X 150mm, 부품 번호 186004937.
예비 크로마 토그래피는 워터스 준비 100 SFC의 UV 감독 시스템에서 수행되었다. 열 :
- Viridis SFC 2 - Ethylpyridine OBD 컬럼, 5 μm의, 19 X 150mm, 부품 번호 186004945
- Viridis SFC 실리카 OBD 컬럼, 5 μm의, 19 X 150mm, 부품 번호 186004918
- Viridis SFC 2 - Ethylpyridine OBD 컬럼, 5 μm의, 19 X 100mm, 부품 번호 186004944
다른 방법 매개 변수 :
- 칼럼 온도 : 40 ° C
- Cosolvent : 메탄올
- 사출 볼륨, 유량, 그리고 그라디언트가 : 숫자에 보고된

3. 대표 결과

유량

예비 LC 분리에 사용되는 유량은 길이와 직경 열, 입자 크기 및 시스템 backpressure를 포함한 여러 요인에 의해 제한됩니다. 낮은 점도의 이산화탄소, SFC의 모바일 단계의 주요 구성 요소는 일반적으로 액체 크로마 토그래피에 사용되는보다 높은 흐름 속도의 사용이 가능합니다. 열 길이와 연관된 backpressure는 해상도를 높이기 위해 더 열을의 사용을 활성화도 낮습니다. 높은 유량은 분리를 완료하는 데 시간을 줄임으로써 처리량을 향상시킬 수 있습니다. 그림 1에 표시된 바와 같이, 색층 프로필은 열 볼륨 당 퍼센트의 변화로 표현되는 그라디언트의 기울기가 일정하게 유지 제공하는 다른 흐름 속도에서 동일합니다 ... 이것은 유량이 증가와 같은 비율의 실행 시간을 줄임으로써 수행됩니다.
그림 1

샘플 해산 및 솔벤트 로딩

혼합물에서 혼합물을 분리하면 샘플 주입하기 전에 완전히 용해되어야합니다. 메탄올, SFC 공동 용매 가장 일반적인, 일반 예비 분리를 위해 일반적으로 요구되는 높은 농도에서 모든 샘플을 solubilize하지 않습니다. 메탄올과 같은 용매의 대형 볼륨은 크로마 토그래피를 왜곡 수있는 강한 용매 효과에 의한 열의 대량 용량을 제한할 수 있습니다. 수정자 흐름 주입, 모든 워터스 준비 SFC 시스템의 표준 특허 구성이 용매 효과를 줄이기 위해 설계되었습니다. 디메틸 sulfoxide (DMSO)는 화합물의 다양한 유형을 solubilize을 정화 연구소에서 정기적으로 사용됩니다. 그림 2, 3 메탄올 주입하는 샘플에 비해 SFC의 DMSO 주사가 achiral 애플 리케이션을위한 높은 로딩과 더 나은 해상도로 발생할 수 방법을 보여줍니다.

참고 : chiral 어플 리케이션의 경우,주의가 DMSO가 심각하게 전통적인 코팅 chiral 정지 단계를 손상시킬 수로 간주되어야합니다. DMSO는 샘플 용해도에 필요한해야하는 경우, 고정 chiral 컬럼이 선택되어야합니다.
그림 2
그림 3

선택성

SFC에서는 여러 열이 일상적 혼합물의 구성 요소에 대한 최고의 해상도와 피크 모양을 제공하는 확인하기 위해 테스트합니다. 화합물 사이 좋은 해결책은 고순도와 대상 화합물 isolations로 연결됩니다. 아래 예제에서, 2 ethylpyridine 컬럼 샘플 혼합물의 다섯 화합물의 우수한 분리를 보여줍니다. 그것은 다른 선택도를 가지고 있기 때문에 실리카 칼럼에 대한 분석 같은 샘플 혼합물은 세 구성 요소 봉우리를 보여줍니다. 0.8 분 정도하고 약간 이상 flavone과 fenoprofen coelute에서 Coumarin과 이부 프로펜 coelute. Flavone과 이부 프로펜은 또한 실리카 칼럼에서 용리 순서를 변경합니다. 케토프로펜 두 컬럼의 다른 봉우리에서 온 잘 구분합니다.
그림 4

스케일링

원유 샘플 혼합물은 일반적으로 유기 용매의 낮은 비율에서 시작하고 비교적 짧은 시간에 유기 용매의 높은 비율로 끝나는 심사 그라디언트로 분석됩니다. 관심의 화합물 잘 해결하는 경우 경사도가 정화 직접 확장할 수 있습니다. 모든 화합물은 일 전에 elute 경우전자 그라디언트의 완료 완벽하게 해결되며, 그라디언트의 길이에 간단한 감소가 허용됩니다. 수정된 그라디언트와 함께 SFC에 사용되는 빠른 흐름 속도가 상당히 목표 화합물의 정화에 필요한 총 시간을 단축.

스케일링 분리는 열 화학 및 입자의 크기뿐만 아니라 적절하게 크기를 조절 주입 볼륨 및 그라디언트와 일치해야합니다. 워터스 예비 SFC 열이 워터스 분석 SFC 컬럼에 우수한 침대 안정성과 유사한 성능을 보장 OBD 기술과 함께 포장됩니다. OBD 예비 열이 밀접하게 상응 분석 컬럼을 일치 밀도 잠자리에 포장됩니다. 이 혁신적인 절차는 우수한 안정성, 재현성, 그리고 효율적으로 예비 열을 생산하고 있습니다.

로딩 연구는 샘플 질량이 칼럼에서 로드할 수있는 얼마나 많은 결정하는 작은 규모에서 수행됩니다. 목표는 해상도를 손상시키지 않고 부하를 극대화하는 것입니다. 향상된 최대 해상도는 격리된 화합물에 대한 높은 부하와 더 순도가 발생합니다. 높은 열 부하는 후속 실험에 대한 충분한 자료를 구하기에 필요한 실행의 수를 줄일 수 있습니다. 로딩 연구에서 크로마 토그래피는 그림 5에 그려져 있습니다. 보수 35 μL 주입 부피는 혼합물에있는 화합물의 모든과 이후에 큰 열의에 예비 실행에 대한 크기를 조정합니다 사이 좋은 해상도를 보여줍니다. 600 μL의 총 볼륨 19 X 150mm 예비 SFC 칼럼에 주입했다. 그림 6은 절연을 위해 사용되는 대규모 크로마 토그래피와 최대 하중에서 소규모 수정 그라데이션을 사용하여 크로마 토그래피를 비교합니다. 절연 및 유지 시간과 시스템 볼륨 및 사출 모드를 포함하여 요인 수있는 분석 및 예비 chromatograms 사이의 해상도로 purification.The 차이에 대해 조사하고 도구로 분석 크로마 토그래피를 사용하는 경우 선택도는 중요한 요소 동일합니다. 특히, 특허 수정자 스트림 분사 모드 *는 용매 효과를 최소화하기 때문에 처리량과 효율성을 향상, 모든 워터스 예비 SFC 시스템에 대한 고용 수 있습니다.
* 미국 특허 # 6,576,125
그림 5
그림 6

Discussion

액체 크로마 토그래피의 기본 원리는 초임계 유체 크로마 토그래피 (SFC)에 적용할 수 있습니다.
초임계 유체 크로마 토그래피는 증가 흐름 속도 빠르게 isolations을 만들고 처리량을 증가에서 실행할 수 있습니다.
제한된 용해도와 샘플은 디메틸 sulfoxide의 용해와 SFC를 사용하여 정화하실 수 있습니다. 샘플 해산 DMSO를 사용하면 샘플 용해도와 관련된 불확실성을 감소하여 정화 작업이 쉬워집니다.
메탄올에 녹아있는 동일한 샘플에 비해 DMSO에 녹아있는 샘플의 해상도와 로딩을 향상시킬 수 있습니다. 더 나은 샘플 해상도 높은 순도와 제품에 연결됩니다. 높은 로딩은 정화 과정의 효율성을 향상시킵니다.
열 선택도는 혼합 구성 요소의 분리에 영향을 미칩니다. 빠른 그라디언트 서로 다른 컬럼을 심사하는 것은 예비 칼럼이 예제의 화합물을 분리에 사용할 수있는 대한 결정에 이르게.
분석 및 예비 OBD 컬럼 사이 확장할 수있는 능력은 사출 볼륨, 경사 및 기울기 시간이 올바르게 크기 조정 및 화학 및 입자 크기가 일정하게 유지되어있는 크고 작은 비늘 모두에서 동일 분판에 연결됩니다. 열 확장성 따라서 높은 정화 처리 효율을 촉진, 최대 식별의 불확실성을 제거합니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Method Station SFC System	Waters	More information available at www.waters.com	Analytical SFC system
SFC-UV Prep 100	Waters	More information available at www.waters.com	Preparative SFC System
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column	Waters	186004937	Analytical SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column	Waters	186004945	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column	Waters	186004918	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column	Waters	186004944	Preparative SFC Chromatography Column