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Summary
Principes de base pour la séparation des composés à partir de mélanges en utilisant la chromatographie fluide supercritique (SFC) sont similaires aux fondements de la chromatographie liquide préparative.
Abstract
Bien que la chromatographie fluide supercritique (SFC) n'est pas une technique nouvelle, préparative SFC devient de plus en plus populaire auprès des progrès dans l'instrumentation, de logiciels et de la chimie. Principes de base pour l'isolement des composés avec SFC sont similaires aux règles fondamentales de grande envergure chromatographie liquide préparative. Dans cette étude, nous illustrons l'effet de débit, de la dissolution de l'échantillon de solvant, et la sélectivité de colonne sur l'isolement de composés à partir d'un mélange. Colonnes emballé avec la densité optimale Bed (OBD) 1 et la technologie avec la chimie correspondant d'assurer une évolutivité facile et prévisible à partir de la petite échelle aux grandes séparations préparatives.
Protocol
1. Préparation des échantillons
- 1 mélange de composés: la coumarine, l'ibuprofène et la carbamazépine; 20 mg / ml chacun dans le méthanol
- 2 Mélange composé: l'ibuprofène et la carbamazépine; 20 mg / ml chacun dans le méthanol
- 3 Mélange composé: l'ibuprofène et la carbamazépine; 20 mg / ml chacun dans le DMSO (diméthylsulfoxyde)
- 4 mélange de composés: 10 mg / mL fénoprofène, 15 mg / mL kétoprofène, 20 mg / mL flavone, 20 mg / ml ibuprofène et 20 mg / ml dans le méthanol coumarine
2. Conditions expérimentales
- Chromatographie analytique a été réalisée sur une méthode Waters système de station de SFC.
Colonne: Viridis SFC 2-éthylpyridine colonne, 5 um, 4,6 x 150 mm, Numéro de pièce 186004937. - Chromatographie préparative a été réalisée sur un Waters Prep 100 Système UV SFC Réalisé. Les Colonnes:
- Viridis SFC 2-éthylpyridine colonne OBD, 5 pm, 19 x 150 mm, 186 004 945 Référence
- Viridis SFC colonne de silice OBD, 5 pm, 19 x 150 mm, 186 004 918 Référence
- Viridis SFC 2-éthylpyridine colonne OBD, 5 pm, 19 x 100 mm, 186 004 944 Référence
- Paramètres Autre méthode:
- Température de la colonne: 40 ° C
- Cosolvant: Méthanol
- Le volume d'injection, du débit, et Dégradés: Rapporté en chiffres
3. Les résultats représentatifs
Débit
Le débit utilisé dans les séparations LC préparative est limitée par un certain nombre de facteurs, dont la longueur et le diamètre de la colonne, la taille des particules, et la contre-pression du système. Faible viscosité de dioxyde de carbone, le principal composant de la phase mobile dans la SFC, permet l'utilisation de débits plus élevés que ceux généralement utilisés en chromatographie liquide. La contre-pression associé à longueur de colonne est également plus faible, permettant l'utilisation de plus de colonnes pour augmenter la résolution. Des débits plus élevés augmentent le débit en réduisant la quantité de temps pour terminer une séparation. Comme le montre la figure 1, le profil chromatographique est le même à des débits différents, à condition que la pente du gradient exprimé dans le changement pour cent par volume de colonne reste constante .. Ceci est accompli en diminuant le temps d'exécution dans la même proportion que le débit est augmenté. 
Dissolution de l'échantillon et la charge de solvant
L'isolement des composés de mélanges exige que l'échantillon soit complètement soluble avant l'injection. Le méthanol, le plus commun de co-solvant dans la SFC, ne solubiliser tous les échantillons à des concentrations élevées habituellement requis pour les séparations préparatives typique. De grands volumes de solvants comme le méthanol peut limiter la capacité de masse de la colonne à cause de forts effets de solvant qui peut fausser la chromatographie. Injection de flux modificateur, la configuration standard brevetée de tous les systèmes des eaux SFC prep, a été conçu pour réduire cet effet de solvant. Diméthylsulfoxyde (DMSO) est utilisé régulièrement dans les laboratoires de la purification de solubiliser de nombreux types de composés. Les figures 2 et 3 illustrent comment des injections de DMSO dans le SFC peut entraîner des charges plus élevées et une meilleure résolution pour des applications achiral par rapport aux échantillons injectés dans le méthanol.
Note: Pour les applications chirales, la prudence doit être considéré comme le DMSO peut sévèrement endommager un revêtement traditionnel phase stationnaire chirale. Si le DMSO doit être requis pour la solubilité de l'échantillon, une colonne chirale immobilisé doit être sélectionné. 
Sélectivité
En SFC, des colonnes multiples sont systématiquement testés afin de déterminer qui offre la meilleure résolution et la forme des pics pour les composants dans un mélange. Bonne résolution entre les composés conduit à des isolements de composés cibles avec une grande pureté. Dans l'exemple ci-dessous, la colonne 2-éthylpyridine montre une excellente séparation des cinq composés dans le mélange de l'échantillon. Le mélange sur un même échantillon sur une colonne de silice montre que trois pics composant car il a une sélectivité différente. Coéluent coumarine et de l'ibuprofène à environ 0,8 minutes et flavones et fénoprofène coéluent un peu plus tard. Flavone et l'ibuprofène également modifier l'ordre d'élution sur la colonne de silice. Le kétoprofène est bien séparé de l'ensemble des autres sommets sur les deux colonnes. 
Mise à l'échelle
Mélanges de l'échantillon brut sont généralement analysées avec un gradient de dépistage qui commence à partir d'un faible pourcentage de solvant organique et se termine à un pourcentage plus élevé de solvant organique dans un temps relativement court. Si les composés d'intérêt sont bien réglés, le gradient peut être réduit directement pour la purification. Lorsque tous les composés éluer avant èmee fin de la pente et sont entièrement résolus, une simple réduction de la longueur de la pente est acceptable. Le débit rapide utilisé dans SFC combinée avec des dégradés modifiés considérablement raccourcir le temps total nécessaire pour la purification de composés cibles.
Séparations d'échelle nécessite correspondant chimie colonne et la taille des particules ainsi que les volumes d'injection échelle appropriée et dégradés. Eaux préparative colonnes SFC sont emballés avec la technologie OBD, assurant la stabilité du lit et des performances comparables à des eaux analytiques colonnes SFC. OBD colonnes préparatives sont emballés au lit densités qui correspondent étroitement à la colonne équivalente analytique. Cette procédure innovante produit colonnes préparatives avec une excellente stabilité, la reproductibilité et l'efficacité.
Une étude de chargement est effectué à la petite échelle pour déterminer combien de masse de l'échantillon peut être chargé sur la colonne. L'objectif est de maximiser la charge sans compromettre la résolution. Amélioration de la résolution de pointe entraîne une hausse des charges et une meilleure pureté des composés isolés. De chargement supérieur colonne de réduire le nombre de pistes nécessaires pour obtenir suffisamment de matériel pour des expériences ultérieures. La chromatographie de l'étude de chargement est représenté dans la figure 5. Le volume d'injection conservatrice 35 uL montre une bonne résolution entre tous les composés dans le mélange et est ensuite mis à l'échelle préparative pour la course sur la grande colonne. Un volume total de 600 uL ont été injectés sur la colonne de 19 x 150 mm préparative SFC. La figure 6 compare la chromatographie en utilisant le gradient à petite échelle modifiées à la charge maximale avec la chromatographie à grande échelle utilisée pour l'isolement. La sélectivité est identique, un facteur critique lors de l'utilisation de chromatographie analytique comme un outil pour l'isolement le scoutisme et les différences dans les purification.The temps de rétention et la résolution entre les analytique et préparative chromatogrammes peuvent être attribués à des facteurs tels que le volume système et le mode d'injection. En particulier, le flux brevetée modificateur de mode d'injection * est employé pour tous les systèmes des eaux SFC préparative, en minimisant l'effet de solvant et donc d'améliorer le débit et l'efficacité.
* Brevet américain n ° 6576125 
Discussion
- Les principes de base de la chromatographie liquide peut être appliqué à la chromatographie fluide supercritique (SFC).
- Chromatographie à fluide supercritique peut être exécuté à des débits plus rapides et isolements faisant augmenter le débit.
- Les échantillons ayant une solubilité limitée peut être dissous dans le diméthylsulfoxyde et purifiée en utilisant la SFC. En utilisant le DMSO pour la dissolution de l'échantillon rend le processus de purification plus facile en réduisant l'incertitude associée à la solubilité de l'échantillon.
- Résolution et le chargement des échantillons dissous dans le DMSO peut être améliorée par rapport aux mêmes échantillons dissous dans du méthanol. Une meilleure résolution de l'échantillon conduit à des produits avec une plus grande pureté. Supérieur de chargement améliore l'efficacité du processus de purification.
- Colonne de sélectivité des impacts de la séparation des composants du mélange. Dépistage des colonnes différentes avec des gradients de vitesse conduit à une décision sur laquelle colonne préparative à utiliser pour isoler les composés dans l'échantillon.
- La capacité d'échelle entre les colonnes analytiques et préparatives OBD conduit à des séparations identiques aux échelles petites et grandes, à condition que le volume d'injection, la pente, et le temps de gradient sont redimensionnées correctement et la chimie et la taille des particules restent constantes. Colonne évolutivité élimine l'incertitude dans l'identification des pics, facilitant ainsi une plus grande efficacité de purification.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Method Station SFC System | Waters | More information available at www.waters.com | Analytical SFC system |
| SFC-UV Prep 100 | Waters | More information available at www.waters.com | Preparative SFC System |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004937 | Analytical SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004945 | Preparative SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004918 | Preparative SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column | Waters | 186004944 | Preparative SFC Chromatography Column |
References
- Optimum Bed Density (OBD) Columns: Enabling Technology for Laboratory-Scale Isolation and Purification. Waters White Paper 720001939EN 2006 Nov.
