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Summary
Princípios básicos para a separação de compostos a partir de misturas utilizando cromatografia com fluido supercrítico (SFC) são semelhantes aos fundamentos da cromatografia preparativa líquido.
Abstract
Apesar de cromatografia com fluido supercrítico (SFC) não é uma nova técnica, preparativa SFC está se tornando cada vez mais popular com os avanços em software, instrumentação e química. Princípios básicos para isolar compostos com SFC são semelhantes às regras fundamentais de grande escala cromatografia líquida preparativa. Neste estudo, ilustramos o efeito da taxa de fluxo, a dissolução da amostra de solvente e seletividade coluna sobre o isolamento de compostos de uma mistura. Colunas empacotadas com Densidade Cama Optimum (OBD) Tecnologia 1 e com a química correspondência garantir a escalabilidade fácil e previsível a partir da pequena escala para separações maiores preparativa.
Protocol
1. Preparação da Amostra
- Mistura composto 1: A cumarina, Ibuprofen, e carbamazepina; 20 mg / mL em metanol cada
- Mistura composto 2: Ibuprofeno e carbamazepina; 20 mg / mL em metanol cada
- Mistura composto 3: Ibuprofeno e carbamazepina; 20 mg / mL em cada DMSO (Dimetil sulfóxido)
- Mistura composta 4: 10 mg / mL fenoprofeno, 15 mg / mL cetoprofeno, 20 mg / mL Flavone, 20 mg / mL Ibuprofen, cumarina e 20 mg / mL em metanol
2. Condições experimentais
- Cromatografia analítica foi realizada em um método de Sistema da Estação de Águas SFC.
Coluna: Viridis SFC 2-Ethylpyridine coluna, 5 mm, 4,6 x 150 mm, Número da peça de 186.004.937. - Cromatografia preparativa foi realizada em um Prep Waters Sistema UV 100 SFC Direção. Colunas:
- Viridis SFC 2-Ethylpyridine coluna OBD, 5 mm, 19 x 150 mm, Número da peça de 186004945
- Viridis SFC OBD coluna de sílica, 5 mm, 19 x 150 mm, Número da peça de 186004918
- Viridis SFC 2-Ethylpyridine coluna OBD, 5 mm, 19 x 100 mm, Número da peça de 186004944
- Outros Parâmetros do método:
- Temperatura da coluna: 40 ° C
- Metanol: co-solvente
- Volume de injeção, vazão e Gradientes: Relatado em números
3. Resultados representante
Vazão
A vazão utilizada nas separações preparativas LC é limitado por uma série de fatores, incluindo o comprimento eo diâmetro da coluna, o tamanho das partículas, ea contrapressão do sistema. Dióxido de carbono de baixa viscosidade, o principal componente da fase móvel na SFC, permite o uso de maiores taxas de fluxo do que aqueles geralmente utilizados em cromatografia líquida. A contrapressão associados com comprimento de coluna também é menor, permitindo o uso de colunas mais para aumentar a resolução. Maiores taxas de fluxo de aumentar o rendimento, reduzindo a quantidade de tempo para completar uma separação. Conforme mostrado na Figura 1, o perfil cromatográfico é o mesmo em taxas de fluxo diferentes, desde que a inclinação do gradiente expresso em variação percentual por volume coluna permanece constante .. Isto é conseguido, diminuindo o tempo de execução na mesma proporção que a taxa de fluxo é aumentado. 
Dissolução da amostra e solvente Loading
Isolar os compostos a partir de misturas exige que a amostra ser completamente solúveis antes da injeção. Metanol, o mais comum co-solvente na SFC, não solubilizar todas as amostras nas concentrações elevadas geralmente necessária para separações típico preparativa. Grandes volumes de solventes como o metanol pode limitar a capacidade de massa da coluna, devido a fortes efeitos de solvente que pode distorcer a cromatografia. Modificador de injeção de fluxo, a configuração padrão de todos os sistemas patenteados Waters prep SFC, foi projetado para reduzir este efeito solvente. Dimetil sulfóxido (DMSO) é utilizado regularmente em laboratórios de purificação para solubilizar muitos tipos diferentes de compostos. Figuras 2 e 3 ilustram como injeções DMSO em SFC pode resultar em maior carga e melhor resolução para aplicações aquiral, em comparação com amostras injetadas em metanol.
Nota: Para aplicações quiral, o cuidado deve ser considerado como DMSO pode danificar seriamente a tradicional fase quiral estacionária revestido. Se DMSO deve ser necessário para a solubilidade da amostra, uma coluna quiral imobilizado deve ser selecionada. 
Seletividade
Em SFC, várias colunas são rotineiramente testados para determinar que fornece a melhor resolução e formato de pico para os componentes em uma mistura. Boa resolução entre os compostos leva ao isolamento de compostos alvo com elevado grau de pureza. No exemplo abaixo, a coluna 2-ethylpyridine mostra uma excelente separação de todos os cinco compostos na mistura da amostra. A mistura mesma amostra analisada em uma coluna de sílica mostra apenas três picos componente porque ele tem uma seletividade diferente. Cumarina e ibuprofeno coelute em cerca de 0,8 minutos e flavona e fenoprofeno coelute um pouco mais tarde. Flavona e ibuprofeno também alterar a ordem de eluição na coluna de sílica. Cetoprofeno é bem separada de todos os outros picos em ambas as colunas. 
Dimensionamento
Misturas de amostra bruto geralmente são analisados com um gradiente de triagem, que começa a partir de uma baixa percentagem de solvente orgânico e termina em um maior percentual de solvente orgânico em um tempo relativamente curto. Se os compostos de interesse são bem resolvidas, o gradiente pode ser escalado diretamente para a purificação. Quando todos os compostos eluir antes ªconclusão e do gradiente e são totalmente resolvido, uma simples redução no comprimento do gradiente é aceitável. As taxas de fluxo rápido usado em SFC combinado com gradientes modificada encurtar consideravelmente o tempo total necessário para a purificação dos compostos alvo.
Separações escala requer correspondência química coluna e tamanho de partícula, assim como volumes de injeção escala apropriada e gradientes. Colunas Waters preparativa SFC são embalados com Tecnologia OBD, assegurando a estabilidade excelente cama e um desempenho comparável às colunas Waters analítica SFC. Colunas OBD preparativa são embalados para a cama densidades que se aproximam da coluna equivalente analítica. Este procedimento inovador produz colunas preparativas com excelente estabilidade, reprodutibilidade e eficiência.
Um estudo de carga é realizada em pequena escala para determinar a quantidade de massa da amostra pode ser carregada na coluna. O objetivo é maximizar a carga sem comprometer a resolução. Resolução melhorada de pico leva para cargas mais altas e melhor de pureza dos compostos isolados. Carregamento maior coluna reduz o número de execuções necessárias para obtenção de material suficiente para os experimentos subseqüentes. A cromatografia a partir do estudo de carga é mostrada na Figura 5. O conservador volume de injeção 35 mL mostra boa resolução entre todos os compostos na mistura e é posteriormente escalado para a corrida preparativa em coluna grande. Um volume total de 600 mL foi injetada na 19 150 mm x coluna preparativa SFC. Figura 6 compara a cromatografia utilizando o gradiente de pequena escala modificada com a carga máxima com a cromatografia em larga escala usada para o isolamento. A seletividade é idêntica, um fator crítico quando se utiliza cromatografia analítica como uma ferramenta de aferição para o isolamento e as diferenças purification.The no tempo de retenção e resolução entre a analítica e preparativa cromatogramas podem ser atribuídas a fatores incluindo o volume do sistema e modo de injeção. Em particular, o patenteado modificador de fluxo * O modo de injeção é utilizado para todos os sistemas Waters preparativa SFC, minimizando o efeito de solventes e, portanto, melhorar a produtividade e eficiência.
* EUA Patente # 6576125 
Discussion
- Os princípios básicos de cromatografia líquida pode ser aplicada a cromatografia com fluido supercrítico (SFC).
- Cromatografia com fluido supercrítico pode ser executado em taxas de fluxo aumentou fazer isolamentos mais rápido e aumentando o rendimento.
- Amostras com solubilidade limitada pode ser dissolvida em dimetil sulfóxido e purificado usando SFC. Usando DMSO para a dissolução da amostra torna mais fácil o processo de purificação através da redução da incerteza associada com a solubilidade da amostra.
- Resolução e carregamento de amostras dissolvidas em DMSO pode ser melhorado quando comparado com as mesmas amostras dissolvidas em metanol. Melhor resolução da amostra leva a produtos com maior pureza. Maior carga melhora a eficiência do processo de purificação.
- Seletividade coluna impactos da separação dos componentes da mistura. Triagem diferentes colunas com gradientes rápido leva a uma decisão sobre qual coluna preparativa de usar para isolar os compostos na amostra.
- A capacidade de escala entre analítica e preparativa colunas OBD leva a separações idênticos em ambas as escalas pequenas e grandes, desde que o volume de injeção, inclinação e tempo de gradiente são dimensionados corretamente e da química e tamanho de partícula permanecem constantes. Escalabilidade coluna remove a incerteza na identificação de pico, facilitando assim a maior eficiência de processo de purificação.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Method Station SFC System | Waters | More information available at www.waters.com | Analytical SFC system |
| SFC-UV Prep 100 | Waters | More information available at www.waters.com | Preparative SFC System |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004937 | Analytical SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004945 | Preparative SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004918 | Preparative SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column | Waters | 186004944 | Preparative SFC Chromatography Column |
References
- Optimum Bed Density (OBD) Columns: Enabling Technology for Laboratory-Scale Isolation and Purification. Waters White Paper 720001939EN 2006 Nov.
