Summary
इस एक कदम से कदम गाइड उद्देश्य, संचालन, और उपन्यास गुरुत्वाकर्षण बल स्पेक्ट्रोमीटर से प्रतिनिधि परिणाम दिखा है.
Protocol
उपन्यास GFS विन्यास करने के लिए परिचय
एक नियमित रूप से प्रकाश माइक्रोस्कोप, एक भूमध्य माउंट, एक कैमरा, और एक कंप्यूटर [चित्रा 1]: GFS कई आवश्यक घटक के होते हैं. सील प्रवाह सेल कक्ष है जो नमूना धारण भी GFS डिजाइन के अनुसार अपरिहार्य है. लाइट माइक्रोस्कोप भूमध्यवर्ती माउंट पर मुहिम शुरू की है ताकि गुंजाइश घुमाया अंतरिक्ष में अलग झुकाव में किया जा सकता है. इस क्षमता गुरुत्वाकर्षण के स्थिर सदिश शोषण किया जा करने के लिए इतना है कि नमूने गतिशील उन्मुख वेक्टर के संबंध में हो तो गुरुत्वाकर्षण के बल piconewton रेंज बल भार के नमूने प्रदान कर सकते हैं अनुमति देता है. कैमरा प्रकाश माइक्रोस्कोप नेत्र लेंस की जगह तो यह नमूने के उन्मुखीकरण में परिवर्तन रिकॉर्ड कर सकते हैं. यह कच्चे डेटा डिजीटल है और कंप्यूटर से छेड़छाड़ करने के लिए वास्तविक शक्ति और दूरी माप में डेटा की व्याख्या. सील प्रवाह कक्ष नमूना हानि के बिना अंतरिक्ष में स्वतंत्रता के सभी डिग्री की अनुमति के लिए बनाया गया है. कक्ष में नमूना अणु है जो एक टर्मिनस के पास एक "लंगर" मनका कि चैम्बर की सतह से चिपके करने के लिए सीमित है रहता है. विपरीत टर्मिनस एक "" मोबाइल मनका है कि कक्ष की सतह से मुक्त करने के लिए सीमित है. यह मोबाइल मनका है, कि गुरुत्वाकर्षण बल द्वारा पर काम किया जा सकता है है जिससे ऐसे कम बल भार पर सीमित अणु खींच परख बफर में मुफ्त चित्रा [2]. नमूना बस खुर्दबीन के नीचे microspheres की एक जोड़ी की तरह दिखता है, हालांकि यह कुछ अनुभव लेने के लिए अच्छा प्रयोग करने योग्य जोड़े जहां दोनों मोती प्रवाह चैम्बर के सतह पर बैठे हैं से एक अणु के लिए उनके लगाव द्वारा मिलकर जोड़े विचार. एक प्रणाली के लिए संशोधन के एक अस्थायी मंच है जो GFS रखती है और स्प्रिंग्स द्वारा निलंबित कर दिया है के अलावा है. इस विन्यास में, एक बार नमूना स्थिति में घुमाया जहां गुरुत्वाकर्षण बल के नमूने पर कार्य कर सकते हैं किया गया है, मंच और अपने सभी घटकों का निरंतर वसंत के खिलाफ गिरा दिया जा सकता है. मुक्त गिरावट के पास मोबाइल मनका पर अभिनय बल शून्य के करीब है और स्प्रिंग्स 'अधिकतम विस्तार पर गुरुत्वाकर्षण बल के रूप में दो बार के रूप में ज्यादा से गुणा किया जाता है. इस तरह, वर्गीकृत प्रतिक्रिया / बल दूरी के लिए अलग बल भार पर एक अणु के व्यवहार को मापने के लिए रेखांकन किया जा सकता है.
1. Microsphere तैयारी
- 0.04% दो मिनट के लिए 3 Aminopropyltriethoxysilane (एसीटोन के साथ कटौती) में 10 मिलीग्राम गिलास या सिलिका मोती के बारे में डूब.
- दोहरा आसुत जल के दो परिवर्तन के साथ कुल्ला और 5 मिनट के लिए 2000 XG पर गोली के लिए अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- युग्मन बफर (0.01 एम pyridine दोहरा आसुत जल के साथ कटौती और 6.0 पीएच को समायोजित) के 5 एमएल जोड़ें, और इस मिश्रण सख्ती से हिला. अपकेंद्रित्र के रूप में ऊपर वर्णित है. इस कदम को तीन बार दोहराएँ.
- मोती के गीला केक करने के लिए, 5% gluteraldehyde समाधान के 2 एमएल जोड़ने (युग्मन बफर के साथ gluteraldehyde कटौती). सख्ती शेक.
- एक डाकू के तहत, कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए मनका / gluteraldehyde मिश्रण को घुमाएगी.
- अपकेंद्रित्र के रूप में ऊपर और aspirate सतह पर तैरनेवाला.
- युग्मन बफर के 5 एमएल में मोती उन्हें सख्ती झटकों से धो और अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate. इस तीन से अधिक बार दोहराएँ.
- मोती वांछित एंटीबॉडी के बारे में 15 μL जोड़ें और सख्ती से हिला. मोती 16-24 घंटे के लिए घुमाया होना चाहिए.
- हुड के तहत, 1 एम ग्लाइसिन शमन समाधान के 5 एमएल (दोहरा आसुत जल के साथ ग्लाइसिन कटौती और 7.0 पीएच को समायोजित) जोड़ें. इस मिश्रण सख्ती शेक और 30 मिनट के लिए बारी बारी से.
- अपकेंद्रित्र और aspirate सतह पर तैरनेवाला.
- धोने बफर (0.1% सोडियम azide; 0.1% BSA, 0.15 एम NaCl, और 0.001 एम EDTA 0.01 एम Tris, पीएच 7.0) के 5 एमएल जोड़ें. इस सख्ती शेक अपकेंद्रित्र, और aspirate सतह पर तैरनेवाला. इस कदम तीन अतिरिक्त बार दोहराएँ.
- कम नमक बफर (0.02 एम imidazole; 5 मिमी MgCl 2, 7.0 पीएच को समायोजित 0.1 एम KCl) के लिए बफर बदलें . तीन बार दोहराएँ.
2. नमूना microspheres के लिए अनुलग्नक
- तैयार मोतियों की एक छोटी राशि ले लो (मोतियों की प्रत्येक केक से लगभग 2 μL बहरहाल, अगर वहाँ बैचों के बीच व्यास में एक बड़ी विसंगति है, यह फायदेमंद है बड़े छोटे मोती 08:01 अनुपात के आसपास का उपयोग करें) और उन्हें जोड़ने परख बफर के साथ एक microcentrifuge ट्यूब. लगभग 5 सुक्ष्ममापी अपने प्रोटीन की एकाग्रता में कमी, परख बफर का उपयोग कर. कम से कम 400 μL की कुल मात्रा बफर, प्रोटीन, और मोती सहित तैयार करें.
- 3 घंटे के लिए लगभग 1 RPM में इस मिश्रण को घुमाएँ (अगर प्रोटीन बहुत ज्यादा उत्तेजित है, यह समग्र और बेकार हो जाएगा).
3. स्लाइड चैंबर तैयार
- कोट 0.01% nitrocellulose (amyl एसीटेट में) के साथ एक मोटी खुर्दबीन स्लाइड. इस स्लाइड के बारे में 10 मिनट के लिए सूखी चलो.
- एक तेज ग्लास कटर के साथ, कवर स्लाइड इतनी के रूप में एक कक्ष बनाने के लिए काटा. यह कांच के चार स्ट्रिप्स की आवश्यकता है.
- तथ्य का प्रयोग करेंकांच और यह बढ़त के दोनों पक्षों पर वैक्यूम तेल का धब्बा भर रेक के ory किनारे.
- प्रेस सूखे nitrocellulose पर तेल लेपित स्ट्रिप्स स्लाइड को कवर करने के लिए स्लाइड की सतह पर एक बॉक्स बनाने के लिए.
- पिपेट μL मनका बॉक्स के अंदर कांच की सतह पर pipetter दोहन द्वारा / प्रोटीन मिश्रण के बारे में 2.
- कैसे बड़े कक्ष है पर निर्भर करता है कम नमक बफर के बारे में 20-400 μL जोड़ें.
- प्रेस है जो पहले से ही वैक्यूम तेल के साथ लेपित है सील और बफर चैम्बर खत्म बॉक्स के शीर्ष पर एक आवरण पर्ची.
- चलो स्लाइड एक स्तर जगह पर बैठने तो मोती के लिए खुद को nitrocellulose के लिए लंगर के लिए पर्याप्त समय है.
4. GFS डाटा अधिग्रहण
- GFS मंच पर माउंट स्लाइड
- मॉनिटर क्या GFS कैमरा रिकॉर्डिंग और वैध के लिए खोज "मनका जोड़े, जिसमें छोटे microsphere बड़े microsphere की भूमध्य रेखा के पास जुड़ा हुआ है.
- जब एक संभावित मनका जोड़ी पाया जाता है, ध्यान की गहराई के माध्यम से जाने के लिए निर्धारित अगर "मोबाइल" मनका स्लाइड की सतह पर आराम नहीं है.
- नोट कोण मोबाइल मनका, एक बार एक उपयुक्त जोड़ी की पहचान की है घ अधिकतम से दूर है (घ अधिकतम = युग्मित microspheres की centroids के बीच अधिकतम दूरी). गुंजाइश वीडियो पाने की स्थिति में ले जाएँ.
- GFS का यात्रा के कोण घ मिनट, घ अधिकतम, और जो अणु की लंबाई के आधार पर 25-90 डिग्री के लिए बुला सकता है घ मिनट रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
- जोड़ी के रूप में रिकॉर्ड घ मिनट से घ अधिकतम करने के लिए और वापस घ मिनट यात्रा है .
- यह एक अच्छा विचार है भी पृष्ठभूमि की एक फिल्म शूट तो यह विश्लेषण के लिए बाद घटाया जा सकता है.
- यदि एक GFS ड्रॉप प्रदर्शन, गुंजाइश वापस घ अधिकतम करने के लिए ले जाने के कम से कम 60 फ्रेम प्रति सेकंड पर ड्रॉप रिकॉर्ड. महत्वपूर्ण हिस्सा पहली दोलन है, लेकिन लंबे समय रिकॉर्ड समय भी गतिशील अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. GFS डेटा विश्लेषण
- डिजिटल "thresholded" छवि में कच्चे वीडियो रूपांतरण और imageJ में मैक्रो चलाने के लिए वीडियो के हर फ्रेम में प्रत्येक मनका के केन्द्रक स्थिति का निर्धारण. यह ड्रॉप वीडियो के लिए भी है.
- एक्स, वाई और Excel में ImageJ से क्षेत्र डेटा डंप और अंक साजिश है.
- यदि एक उचित मनका जोड़ी वीडियो द्वारा अधिग्रहीत किया गया था, ग्राफ में नजर कूबड़ उनके निकटतम (घ मिनट) पर जा रहा है मोतियों की सूचक है और ग्राफ के शीर्ष पर घ अधिकतम की स्थिति है.
- इस डेटा का उपयोग, प्रत्येक मनका की त्रिज्या ImageJ में ठीक निर्धारित किया जाना चाहिए और यह सब जानकारी नेस्टेड समीकरण में डाल दिया है:
घ = [(छ पाप α) 2 + (क्योंकि α + घ अधिकतम छ - छ) 2] 0.5
छ = [घ मिनट 2 + आर ख 2 - (नि. एक + आर एंड बी) 2] 0.5 = r पाप ख β
ग = घ अधिकतम - आर एक - छ
(घ = centroids के बीच दूरी, छ = गुरुत्वाकर्षण के बल, α = उद्देश्य लेंस के समानांतर डिग्री कोण, आर एंड बी मोबाइल मनका के = त्रिज्या, आर एक = त्रिज्या लंगर मनका, की धुरी बंद लगाव के β = कोण लंगर मनका की भूमध्य रेखा. - मोबाइल मनका के फिट त्रिज्या का उपयोग करना है जो भी इसकी मात्रा पैदावार और मनका के घनत्व, मोबाइल मनका अणु पर प्रदान बल दिया विलायक के उछाल के बाद piconewtons में गणना की जा सकती है घटाया. इस विधि piconewtons में सीमित अणु पर बल उपायों और नैनोमीटर में एंटीबॉडी संलग्नक के बीच पूर्ण अणु की लंबाई एफ = वी (DB) एक (एफ = बल, वी = मात्रा, घ = कांच microsphere के घनत्व, एक = त्वरण की गणना गुरुत्वाकर्षण के कारण, ख = विस्थापित पानी के घनत्व).
6. प्रतिनिधि परिणाम:
यदि मनका प्रस्तुत करने का सही ढंग से किया है, वहाँ न्यूनतम मनका एकत्रीकरण यद्यपि वहाँ अभी भी एक सामयिक मनका पेड़ों का झुरमुट हो सकता है. जब गुंजाइश के माध्यम से देखा, मोती चाहे बनती या कक्ष में नहीं एक उचित वितरण होना चाहिए.
यह महत्वपूर्ण है जितना संभव कंपन कम से कम, यह या तो एक हवाई तालिका, विशेष सदमे एक तिपाई है कि धारण एक EQ माउंट के लिए पैर को अवशोषित, या सिस्टम का इस्तेमाल करता है कि स्प्रिंग्स कंपन अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर.
एक और उपयोगी टिप सील प्रवाह कक्ष के विषय में यह एक स्तर की मेज पर के बारे में पाँच मिनट के लिए खड़े के बाद यह पूरी तरह से निर्माण किया गया है है. यह किसी भी स्वाधीन बड़ा मोती nitrocellulose की परत में बफर और बाकी के माध्यम से नीचे फ्लोट करने की अनुमति देता है. यदि स्लाइड के बजाय पूरा होने पर सीधे घुड़सवार थे, अन्वेषक लगातार सचमुच देखने के क्षेत्र के माध्यम से उड़ान मोतियों के साथ सौदा होगा, और अगर इस वीडियो अधिग्रहण के दौरान होता है यह वें भ्रष्ट कर सकते हैंई प्रयोग. यदि यह ठीक से किया है, मनका उड़ान और काफी कम से कम है क्लीनर वीडियो परिणाम.
जब एक संभावित मनका जोड़ी GFS ऑपरेटर द्वारा पहचाना जाता है, यह एक प्रारंभिक रोटेशन के माध्यम से डाल करने के लिए जोड़ी के व्यवहार की निगरानी के लिए उपयोगी है. शायद ही कभी, बड़े मनका मजबूती स्लाइड करने के लिए नहीं चिपका है. यदि ऐसा होता है, वहाँ जोड़ी के उपयोग में कोई फायदा नहीं है क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि बड़ा अधिग्रहण की अवधि के माध्यम से एक निश्चित स्थिति में मनका रहने लंगर है. यदि जोड़ी स्थिर है और प्रदर्शन नहीं करता है "लंगर मनका रोल है," तो यह प्रयोग के लिए उपयुक्त है.
गुरुत्वाकर्षण के सापेक्ष कोण में परिवर्तन बनाम मनका जुदाई दूरी के एक भूखंड का अधिग्रहण डेटा का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अच्छा प्रतिनिधि परिणाम एक पठार पर थोड़ा जुदाई दिखाने के और के रूप में मोबाइल मनका ही गुरुत्वाकर्षण के प्रभाव की वजह से लंगर मनका से मुक्त, ग्राफ अधिक जुदाई दिखाएगा होगा. यह जारी है जब तक एक अच्छा चोटी तक पहुँच जाता है जो घ अधिकतम कहा जाता है और वक्र नीचे शुरू होता है फिर आधारभूत लौटने घ मिनट [चित्रा 1 ]. आदर्श परिस्थितियों में, इस हस्ताक्षर सममित है. एक गैर प्रतिनिधि परिणाम बेतुका कोई अलग मिनट घ अधिकतम घ मिनट पैटर्न घ दिखाने पैटर्न के साथ एक ग्राफ दिखा सकते हैं, या यह separations कि परिमाण के एक एकल शायद संकेत अणु के लिए आदेश भी उच्च रहे हैं दिखाने के लिए वहाँ के बीच धूल का एक टुकड़ा था मोती, या हो सकता है कि मोबाइल मनका बस संलग्न किया गया था बिल्कुल नहीं. जोड़ी खोजने, यह शूटिंग, यह प्रसंस्करण, और यह विश्लेषण करने की प्रक्रिया कई रोकने के अंतराल जहां अनुचित मनका जोड़े मारी गईं हैं. तो, अगर आप पूरी प्रक्रिया के अंत करने के लिए और आप एक अणु की लंबाई है कि पिछले परिणामों के साथ संगत है, एक बहुत विश्वास है कि मूल मनका जोड़ी प्रतिनिधि है और परिणामों में शामिल किया जा सकता है है किया जा सकता है. एक अच्छा दिन पर, मनका जोड़े शॉट के बारे में आधे के माध्यम से लिया जा सकता है एक वैध डेटा बिंदु बन. उदाहरण के लिए, मायोसिन MF20 और MF30 एंटीबॉडी के बीच coiled तार की लंबाई, EM डेटा और AFM, 100 2,7,8,9 एनएम दृष्टिकोण करने के लिए डेटा के आधार पर जाना जाता है. यदि परिणाम कई बार यह लंबाई है, नमूना एकत्रित किया है. यहाँ प्रस्तुत परिणामों मानक GFS रोटेशन प्रयोगों से हैं और 96 एनएम ± 5 एनएम की दूरी को प्रदर्शित करने के लिए, चित्रा [2] जो MF30 की माप के साथ मिलकर सहमत हैं (जो subfragment-2 मायोसिन के एन टर्मिनस पर बांध) और MF20 (जो प्रकाश meromyosin में बांध) मायोसिन पर एंटीबॉडी जुदाई दूरी साहित्य मूल्यों से deduced [चित्रा 3]
चित्रा 1. GFS विन्यास. GFS का प्रमुख भागों में चिह्नित कर रहे हैं.
चित्रा 2 GFS सिद्धांत के योजनाबद्ध. बाईं ओर लंगर मनका के केन्द्रक से एक न्यूनतम दूरी पर मोबाइल मनका के केन्द्रक से पता चलता है. के रूप में GFS घुमाया है, मोबाइल मनका गुरुत्वाकर्षण जो भी सीमित अणु की धुरी के साथ समानांतर चल सदिश के साथ aligns. इस स्थिति में, मोबाइल और लंगर मोतियों की centroids के बीच की दूरी के एक अधिकतम पर है. शीर्ष सही एक GFS फिल्म से एक प्रतिनिधि टुकड़ा से पता चलता है. नीचे दाएँ GFS के दौर से गुजर रोटेशन की एक छवि है.
चित्रा 3 प्रतिनिधि परिणाम ग्राफ के बाईं तरफ घ मिनट दिखा, 17.78 microns के एक रिश्तेदार अलगाव में घ अधिकतम, और मोतियों के बीच रिश्तेदार जुदाई के बारे में 17.75 microns के आधारभूत आसपास घ मिनट के लिए एक वापसी .
चित्रा 4 GFS रोटेशन प्रयोग MF20 और MF30 औसत एंटीबॉडी 96 एनएम के बीच की दूरी को दिखाने के प्रतिनिधि परिणाम . यह S2 की अनुमानित लंबाई का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 5 मायोसिन द्वितीय डिमर GFS के साथ एंटीबॉडी और / या actin संलग्नक सहित उपयोग के लिए संभव संलग्नक दिखाने के लिए इस्तेमाल किया. विभिन्न लगाव की संभावनाओं की अनुमति देता है के लिए विभिन्न रणनीतियों GFS विभिन्न क्षेत्रों को मापने के लिए, या बल सीधा लागू या मायोसिन डिमर का रॉड डोमेन के लिए समानांतर.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
जब एक डिजिटल thresholded प्रतिनिधित्व करने के लिए एक फिल्म में परिवर्तित, यह thresholded छवि के लिए वीडियो के हर फ्रेम में एक ही क्षेत्र को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. क्योंकि एक मनका जोड़ी में मोतियों कदम एक दूसरे से स्वतंत्र, thresholded क्षेत्रों में किसी भी बहाव भी मोतियों की centroids रिश्तेदार के बीच दूरी बहाव और महत्वपूर्ण त्रुटि परिचय पैदा कर सकता है. दहलीज क्षेत्र पर नियंत्रण के लिए 5 एनएम नीचे 26 एनएम से दूरी की माप में पांच गुना त्रुटि कम. यह भी दोनों मोतियों के लिए एक सटीक माप त्रिज्या प्राप्त मोतियों के बीच अनुपात के रूप में अंतिम गणना है कि दोनों दूरी और बल मूल्यों की पैदावार के लिए महत्वपूर्ण है महत्वपूर्ण है.
प्रणाली कई मायनों में संशोधित किया जा सकता है. सर्वाधिक हाल के सिस्टम एक निरंतर वसंत के खिलाफ पूरे GFS छोड़ने के द्वारा सीमित अणु वर्गीकृत बल प्रदान करता है. एक बार वसंत निरंतर निर्धारित किया जाता है, एक तीसरे व्यक्ति के वीडियो खुर्दबीन वीडियो ले लिया है और दोनों एक साथ synched हैं एक ही समय पर प्राप्त किया जा सकता है. फिर खुर्दबीन कैमरे से वीडियो के प्रत्येक फ्रेम GFS की स्थिति के अनुसार बल मूल्य दिया जा सकता है के रूप में यह तीसरे व्यक्ति, synched फिल्म में गिरा दिया है. वीडियो के प्रत्येक फ्रेम एक इसी बल मूल्य है कि मोबाइल मनका गिरावट और वसंत प्रणाली के बाद पलटाव के दौरान प्रदान कर रहा है. वीडियो के प्रत्येक फ्रेम भी निरपेक्ष अणु की लंबाई प्राप्त करने के लिए विश्लेषण किया है. इस तरह, प्रत्येक असतत बल प्रत्येक असतत दूरी माप के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है है, इस प्रकार वर्गीकृत वक्र / बल दूरी को देखने के लिए कैसे एक अणु बढ़ती भार के तहत व्यवहार उपलब्ध है. इस तकनीक को भी बल microsphere ऊपर दो बार गुरुत्वाकर्षण के लिए प्रदान कर सकते हैं गुणा करता है. इसी तरह, मनका की मात्रा है जो अंततः बल प्रोफ़ाइल निर्धारित करता है के रूप में इस प्रणाली हर बार एक ही दूरी से गिरा दिया डिज़ाइन किया गया है. इसके विपरीत, रोटेशन प्रयोग हमेशा केवल एक ही बल मान देता है. अतिरिक्त सामान भी छिड़काव कोशिकाओं, प्रतिदीप्ति, बढ़ स्वचालन, या यहां तक कि ऑप्टिकल जाल जैसे भी संभव हो रहे हैं. आधार प्रणाली के एक महत्वपूर्ण विशेषता के बाद से अपनी कम लागत और मजबूती है, सिस्टम शैक्षिक प्रयोगशालाओं में एकल अणु परख प्रदर्शनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस प्रणाली के लिए आवेदन पहले से ही मायोसिन की coiled तार के रूप में प्रतिनिधि के परिणाम में वर्णित के संरचनात्मक प्रकृति का निर्धारण करने के लिए उपयोगी सिद्ध कर दिया है. इसके अलावा, यह भी AFM डेटा और दिखाया अनुरूप डबल असहाय nucleotide 10 का टूटना बल के विषय में परिणाम की तुलना में 12 बीपी डीएनए की लंबाई की पुष्टि की. साइट विशिष्ट एंटीबॉडी संलग्नक या अन्य ligands या भी विषाक्त पदार्थों का उपयोग करके प्रदान लचीलेपन के कारण, GFS संरचना के nanoscale और बलों की picoscale पर ज्यादा वैज्ञानिक संरचनात्मक डेटा उत्पन्न करने की ओर अग्रसर है. अणु, मापा जा सकता फैला, और परख के आधार पर अलग छेड़ा. प्रणाली में बल के तहत पहले से ही अणु अभिकर्मकों के अधीन किया जा सकता है संभव संकेत transduction या enzymatic गतिविधि निर्धारित है. एक अणु के अध्ययन के लिए संभावनाओं के समय में इस बिंदु पर अंतहीन लगते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस सामग्री को अनुदान नंबर 0842736 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Polysciences, Inc. | 919-30-2 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 110-86-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G7776 | |
| Glycine | Research Organics | BP381-1 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 9682T | |
| Sodium azide | Amresco | 71289 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | AMR-0332-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | MSI | E9884 | |
| Nitrocellulose | Sigma-Aldrich | 60443 | |
| N-N Dimethyl Formamide | Extracted from Large New | D4254 | |
| Rabbit skeletal myosin II | Zealand White Rabbits (7-8) | NA | |
| MF30 antibody (9-10) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MF30 | |
| MF20 antibody (6) | Hybridoma Bank | MF20 | |
| Lab microscope | Boreal | WW57905M00 | |
| Equatorial mount | Celestron | CG-5 | |
| Digital video cam | Sony Corporation | XCDV60 | |
| Caliper release | Cabelas | IA-415482 | |
| Compression spring | Jones Spring Co. | 723 | |
| Extension spring | Jones Spring Co. | 770 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | NA | |
| Fire-i drivers & application | Unibrain | 3.80 | |
| Excel | Microsoft | NA |
References
- Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure. Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).
- Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin. Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).
- Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers. Nature. 377, 251-254 (1995).
- Gawalapu, R. K., Root, D. D. Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft. Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).
- Kellermayer, M. S. Z. Visualizing and manipulating individual protein. Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).
- Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin. J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).
- Godfrey, J. E., Harrington, W. F. Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment. Biochemistry. 9, 886-893 (1970).
- Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer. Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).
- Xu, J., Root, D. D. Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface. Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).
- Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy. Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).
