Summary
操作能力在体外培养人类神经干/前体细胞（hNSPCs）允许调查作为细胞移植用于治疗目的的实用价值与探索人类的神经系统发育。该协议提出希望增加人类干细胞研究的可重复性的培养和传代hNSPCs的方法。
Abstract
操作能力在体外培养人类神经干/前体细胞（hNSPCs）提供了一种手段调查细胞移植用于治疗目的的效用，以及探索人类神经系统发育和病理的许多基本过程。该协议提出了希望规范这种技术和提高人类干细胞研究的可重复性的一个简单的方法，培养和传代hNSPCs。我们使用的hNSPCs尸体产后大脑皮质中分离，由国家人类神经干细胞资源，并成长为烧瓶壁的文化与纤维连接蛋白（Palmer等人，2001年。Schwartz等人，2003年）涂层。我们的文化我们hNSPCs DMEM培养液：无血清F12媒体补充EGF，FGF和PDGF，通过他们的1:2，大约每7天。利用这些条件下，广大文化细胞保持双极形态和未分化的神经干细胞（如nestin和SOX2）表达的标记。
Protocol
注意 ：对于我们hNSPCs的日常培养，我们改变了50-100％的媒体隔日通常通过他们1:2每周一次。文化传媒，包含20％位9500 1X抗生素/ antimycotic，和生长因子（EGF，FGF和PDGF在40毫微克/毫升）的DMEM：F12基地媒体。
准备涂层烧瓶中，游离的细胞
- 为了准备新的传代细胞，大衣10微克/毫升EMEM人纤维连接蛋白为4小时，或隔夜与T25烧瓶，在37 ° C间组织培养箱内培养烧瓶。前传代细胞，去除纤维连接蛋白的解决方案，并用PBS冲洗烧瓶。
- 从细胞传代，以新的纤维连接蛋白涂层烧瓶（如最终成交量的一半，每个烧瓶媒体将“空调”的媒体），转移旧的“空调”的媒体。这些培养条件，帮助保持这些细胞的未分化状态。
- 一旦所有的媒体都从传代的细胞取出，冲洗细胞一次，用PBS。小心不要干细胞。
- 直接加入到细胞为T25烧瓶（1.0-1.5毫升）细胞解离缓冲器（CDB）。在缓冲区中孵育细胞在室温下约5分钟。轻轻拍打烧瓶中，将有助于加快细胞脱落。
离心，Resuspending，电镀细胞
- 烧瓶与分离的细胞中加入含血清的介质（DMEM：F12与10％热灭活胎牛血清）（使用〜3倍量的国家开发银行）。删除到15毫升锥形管媒体和细胞。体积小，使用新鲜的含血清媒体冲洗烧瓶，并收回剩余的细胞。
- 在1000 rpm（〜200xg）的媒体和细胞离心5分钟。
- 吸过的含血清媒体和新鲜培养基重悬细胞，吹打起来，使一个同质化的细胞悬液。
- 每个新瓶转移到了1:2分割的悬浮细胞的一半。注意烧瓶的新通道数量。
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Discussion
我们发现，这个协议提供了可靠的文化hNSPCs。我们的细胞的一个关键因素是，他们需要保持相当密集的文化，不能传代细胞稀疏的点。在我们手中，稀疏的文化成长非常缓慢或完全停止分裂。出于这个原因，我们通常会分裂我们的文化为1:2或1:3时，文化是非常密集。涂层与纤维连接蛋白的培养皿的表面是很重要的，因为它可以促进良好的细胞粘附和迁移，但与层粘连蛋白，它也允许使用细胞解离缓冲器（CDB）来分离细胞。层粘连蛋白是细胞附着太强大了，需要使用的一种蛋白水解酶（如胰蛋白酶），细胞脱落。非酶CDB是首选胰蛋白酶，因为细胞表面蛋白水解裂解可能导致形态的变化，随着时间的推移在hNSPCs。此外，在条件培养基培养hNSCPs有助于维持这些细胞的未分化状态。
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Acknowledgments
作者非常感谢菲利普博士H.国家人类神经干细胞在儿童医院研究所提供hNSPCs在他们的培养和初始指令，奥兰治县的资源施瓦茨。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin) | Reagent | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | Reagent | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF, human basic recombinant | Reagent | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | Reagent | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF, human recombinant | Reagent | BD Biosciences | CB40052 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Cell Culture Flask, 25 cm2 | Tool | Corning | 10-126-28 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Fibronectin, human, natural | Reagent | BD Biosciences | CB40008A | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Human Neural Stem/Precursor Cells | Cells | National Human Neural Stem Cell Resource | ||
| Cell Dissociation Buffer | Reagent | Invitrogen | 13150-016 |
References
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
