Summary
Här visar vi hur du använder analys Närhet Ligation (PLA), med en kombination av antikroppar mot visualisera Protein Benmorfogenetiska (BMP) signalering i fasta celler. Denna teknik gjorde att vi kunde följa den nukleära ackumulation av endogena BMP aktiveras effektormedierad komplex och kvantifiera deras nivåer över tiden under BMP4 stimulering.
Abstract
BMP är ansvariga för ett stort antal utvecklings-och biologiska effekter. BMP-receptorerna aktiverar (fosforylera) den Smad1/5/8 effektenheter som sedan bildar ett komplex med Smad4 och translocate till kärnan där de fungerar som transkriptionsfaktorer att inleda BMP specifika nedströms effekter 1. Traditionella immuno-fluorescens tekniker med antikroppar mot fosfor-Smad peptider uppvisar låg känslighet, hög bakgrund och erbjuda grov kvantifiering eftersom de bygger på intensiteten av antikroppen signalen särskilt om det är ljuskänslig lysrör. Dessutom kan fosfor Smads inte alla vara i komplex med Smad4 och engagerade i aktiv transkription.
In situ PLA är en teknik kan upptäcka protein interaktioner med hög specificitet och känslighet 2-4. Denna nya teknik par antikroppar erkännande med förstärkningen av DNA-surrogat av proteinet. Det genererar en lokaliserad, diskret signal i form av fläckar avslöja den exakta positionen för erkännande händelsen. Antalet signaler som kan räknas och jämföras ger en mätning. Vi appliceras på plats PLA, med hjälp av Duolink kit, med en kombination av antikroppar som gör att detektion av BMP signalering effektenheter phospho-Smad1/5/8 och Smad4 endast när dessa är i närheten, dvs i en komplex, som inträffar bara med signalering aktivering. Detta gjorde det möjligt för första gången, visualisering och mätning av endogena BMP signalering med hög specificitet och känslighet under en tidsperiod försök enligt BMP4 stimulering.
Protocol
1. Plätering av celler och Behandling med BMP
- Kultur Neuro2a celler i GMEM kompletterad med 10% FBS, 1x Icke-essentiella aminosyror (NEAM), 1x natrium pyruvat och 1x L-glutamin. Dela upp celler med trypsin (0,05%-EDTA) och plattan 15,000-20,000 celler per brunn i en 16-väl kammare bild.
Kultur HEK293T eller Cos7 celler i DMEM kompletterad med 10% FBS, 1x L-glutamin och 1x Penicillin / streptomycin. Sterilisera polysine diabilder genom att sänka ner dem i 70% etanol och med Immedge penna rita 1 cm 2 brunnar. Dela upp celler med trypsin (0,05%-EDTA) och plattan 20,000-25,000 celler per väl i 50 l medium. - Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktig, 5% CO 2 inkubator.
- Efter 24 h ersätta mediet med serum gratis GMEM (kompletterad med 0,1% albumin, 1x NEAM, 1x natrium pyruvat och 1x L-glutamin) för Neuro2a eller med serum gratis DMEM (kompletteras med L-glutamin och 1x Penicillin / streptomycin) för HEK293T / Cos7 och inkubera celler i 2-3 h. Håll tre brunnar med celler under normala odling förhållanden (dvs. 10% FBS) att använda som kontroller.
- Behandla cellerna med dorsomorphin (hämmare av BMP väg, 2 M) eller BMP4 (25 ng / ml) för önskad tid (t.ex. 10 min-1 h) 5.
2. Fixering och Permeabilization
- Förbered fixativ, 4% PFA. Väg 4 g av PFA att förbereda en 4% lösning i 100 ml PBS. Värm lösningen vid 50 ° C tills det är klart. Filtrera lösningen genom ett 0,22 ìm filter och förvara vid 4 ° C fram till användning. Använd färska fixativ (lagras inte i mer än 2 dagar).
- Sug mediet från brunnarna och tvätta med 1xPBS. Pipettera ej lösningarna direkt på celler som detta kan resultera i att cellerna lossnar. Innan vi går till nästa steg, om kammare bilderna används avlägsna kamrar, men lämna kisel runt brunnarna.
- Tillsätt 50 l 4% PFA och inkubera i 10 min, vid RT, utan agitation.
- Tvätta cellerna med PBS för 3 x 5 min i en Coplin burk med agitation vid RT.
- Behandla celler med 0,5% Triton X-100 i PBS i 10 min utan omrörning vid RT.
- Tvätta cellerna med 0,05% Tween 20 i TBS (TBS-T) i 3 x 5 min i en Coplin burk med agitation vid RT.
3. Blockering
- Knacka bort TBS-T. Tillsätt en droppe Duolink II blockerande lösningen (1x) per brunn.
- Inkubera glasen i en förvärmd fuktkammare för 1 timme vid 37 ° C.
4. Primära antikroppar
- Blanda och späd aP-Smad1/5/8 (kanin polyklonala) på 1:100 och A-Smad4 (monoclonal) på 1:100 i Duolink II Antibody Diluent (1x). Förbered också aP-Smad1/5/8 och en-Smad4 ensam vid samma koncentrationer som ska användas för kontroller.
- Tryck ut den blockerande lösningen från bilderna. Ta bort så mycket blockerande lösningen som möjligt, men var extra försiktig att inte låta cellerna torka innan du lägger till antikroppen. Tillsätt 40 l av antikroppen lösningar till brunnarna. I ett väl bara lägga Antibody Diluent som en ytterligare negativ kontroll.
5. PLA sonder
- Späd två PLA sonder (Duolink II anti-mus minus och Duolink II anti-kanin PLUS) 01:05 i Antibody Diluent.
- Tryck ut den primära antikroppen lösning från bilderna. Tvätta bilderna 2 gånger 5 minuter vardera med 1x Duolink II tvättbuffert A i ett Coplin burk med agitation vid RT.
- Knacka bort tvättbufferten A från bilderna och lägga PLA sond lösningen (40 l / brunn).
Inkubera glasen i en förvärmd fuktkammare för 1 timme vid 37 ° C.
6. Ligering
- Vortexa Duolink II Ligation lager (5x) och späd 01:05 i hög renhet vatten och blanda. Vid beräkning av volymen av vattnet, ta hänsyn till volymen av ligas som kommer att läggas till en slutlig spädning av 1:40 strax före tillägg av blandningen till brunnarna.
- Kranen PLA sonden lösning från bilderna. Tvätta bilderna i 1x tvättbuffert A i 2 gånger 5 minuter vardera i en Coplin burk med agitation vid RT.
- Ta ut ligas ur frysen med en frysning blocket (-20 ° C). Lägg till ligas till Ligation lösningen (beredd enligt 6.1) med en 1:40 spädning och skaka.
- Knacka bort tvättbufferten A från bilderna och lägg till Ligation-ligas lösning till varje brunn (40 l / brunn). Inkubera glasen i en förvärmd fuktkammare i 30 minuter vid 37 ° C.
7. Förstärkning
Notera: Ljus känsligt reagens. Håll bilderna skyddas från ljus.
- Späd Duolink II Förstärkning lager (5x) 01:05 i hög renhet vatten och blanda. Vid beräkning av volymen av det vatten tar hänsyn till volymen av polymeras som kommer att läggas till en slutlig spädning av 1:80 strax före tillägg av mixen till the brunnar.
- Knacka bort Ligation-ligas lösning från bilderna. Tvätta bilderna i 1x tvättbuffert A med i 2 gånger 2 minuter vardera i en Coplin burk med agitation vid RT.
- Ta ut polymeras från frysen med en frysning blocket (-20 ° C). Lägg till polymeras till Amplifiering lösningen (beredd enligt 7.1) i en 1:80 spädning och skaka.
- Knacka bort tvättbufferten A från bilderna och lägg till förstärkning-polymeras lösning till varje brunn (40 l / brunn). Inkubera glasen i en förvärmd fuktkammare för 100 min vid 37 ° C.
8. Förberedelse för Imaging
Notera: Ljus känsligt reagens. Håll bilderna skyddas från ljus.
- Kranen förstärkning-polymeras lösning från diabilder och tvätt för 2 gånger 10min vardera i 1x Duolink II tvättbuffert B i en Coplin burk med agitation vid RT.
- Doppa dem i 0,1 x tvättbuffert B.
- Ta bort silikon från 16-bra bild helt. Tillsätt ~ 40μl av Duolink II Montering Medium med DAPI på täckglas och försiktigt placera den över de prover som att trycka på den en aning så att det inte finns några luftbubblor under locket halka. Fix och försegla täckglas på bilden med hjälp av nagellack. Vänta minst 15min innan du fortsätter till avbildning.
- Analysera prover med en konfokala eller fluorescensmikroskop. Skaffa digitala bilder.
9. Kvantifiering
Notera: Ljus känsligt reagens. Håll bilderna skyddas från ljus.
- Använd Duolink ImageTool att räkna signaler på bilderna för att få en mätning av signal-nivå.
- Jämför mätningar och göra ett diagram.
10. Representativa resultat
Resultat från en in situ PLA Experimentet visar som diskreta fluorescerande fläckar. Placeringen av signal beror på de studerade specifika proteiner.
Figur 1. In situ PLA på Neuro2a celler efter BMP4 stimulering. Cellerna behandlades med 2 mikroM dorsomorphin (hämmare av BMP vägen) (A) eller 25 ng / ml BMP4 (B) i 60 min eller lämnas obehandlad (CE). Antikroppar mot P-Smad1/5/8 och Smad4 användes för att upptäcka de aktiva komplex i A och B. Den primära antikroppar aP-Smad1/5/8 ensam (C) och en-Smad4 ensam (D) eller underlåtenhet av den primära antikroppar (E) användes som kontroller. Blå: DAPI; Röd: PLA signal. Bilder erhölls med en Leica SP5 konfokalmikroskop.
(F) PLA signaler räknades med Duolink ImageTool programvara och det genomsnittliga antalet platser i kärnan per cell visas i diagrammet. (G) Neuro2a celler lämnas obehandlade eller behandlas med Dorsomorphin (2 M) eller BMP4 (25 ng / ml) i 60 min. Cellerna var lyseras och de proteiner som utsattes för SDS-PAGE och analyseras av immunoblotting med aP-Smad1/5/8 och A-PCNA som lastning kontroll. (*) Icke-specifika band. Observera att aP-Smad1/5/8 antikroppen inte kan skilja mellan de tre olika proteiner som finns i komplex med Smad4.
Discussion
Visualisering av proteinkomplex på plats är stor efterfrågan, särskilt för studier i signalering där proteininteraktioner och protein modifiering är de medel som cellerna använder för att skicka en signal från sin yta till kärnan. Det har inte varit möjligt att visualisera och kvantifiera komplex mellan två kroppsegna proteiner in situ med immunofluorescens förut. Co-lokalisering av antikroppar visar låg upplösning och kan inte användas för att visualisera sann interaktion. PLA är en ny teknik som forskarna har börjat använda i olika system med stor framgång 6, 7. Här visar vi hur du använder PLA inte bara för att visualisera, men också att kvantifiera endogen komplex mellan Smad effektenheter aktiveras nedströms BMP stimulering över tiden. Vi använde olika celler vävnadskultur inklusive Neuro2a och förlitade sig på kommersiella antikroppar upp i olika arter (mus a-Smad4 och kanin aP-Smad1/5/8) för att uppnå detta (fig 1). Denna metod gjorde att vi, för första gången, för att se aktivering av BMP effektormedierad komplex över tiden och inte bara närvaron av fosforyleras Smad1/5/8, som inte får alla vara engagerade i aktiv komplex med Smad4. Vi räknade signalerna (figur 1F) och jämfört mätning med en kvantifiering från immunoblot av samma celler 8 (figur 1G). Vi drog slutsatsen att antalet platser ger en korrekt jämförande mätning av signalering nivåer över tiden. Tekniken tillämpades också på andra cellinjer (HEK293T och Cos7) med liknande resultat (data visas inte).
Principen för tekniken bygger på två unika sonder som medföljer Duolink satsen. Varje PLA sond består av en sekundär antikropp kopplad till en unik syntetisk oligonukleotid, som fungerar som en reporter. Närheten till sonderna kan DNA ligation på den exakta platsen där dessa sonder bifogas i närheten. Avståndet mellan oligonukleotider, som tillåter DNA-hybridisering och ligatur är liten (<40nm) och kan därför endast proteiner som interagerar tillåter ligatur. Det knyts ihop DNA kan sedan amplifieras och påvisas med hybridisering av märkta oligonukleotider av det förstärkta sekvensen. Den förstärkningen är specifikt eftersom det beror på DNA-DNA-hybridisering principer och ger också hög känslighet som knyts ihop DNA förstärks flera gånger, vilket resulterar i förbättring av den ursprungliga ligering händelsen. Det förstärkta DNA detekteras genom hybridisering med märkta oligonukleotider och ger en synlig och ganska stor plats. Som fläckarna kan räknas ger PLA-signalen inte bara exakt geografisk information (platsen för interaktionen händelser), men också ett objektivt sätt att kvantifiera dessa händelser 2-4.
Andra tekniker som används för detektion av proteininteraktioner omfattar kooperativa immunoprecipitation, immunofluoresence och fluorescerande Resonance Energy Transfer (FRET). Co-immunoprecipitation analyser används i stor utsträckning gör det möjligt isolering av proteinkomplex. Metoden åtföljs av immunoblotting vilket innebär att proteinerna måste uttryckas på relativt höga nivåer för att kunna upptäckas. Problem med hög bakgrund eller icke-specifik bindning av vissa proteiner för att kulorna är ibland svåra att övervinna i samarbete immunoprecipitation. Dessutom, co-immunoprecipitation analyser möjliggör detektion av proteiner som kan vara del av ett protein komplex, men kan inte urskilja de som är mycket nära att interagera fysiskt med varandra. Dessutom kan samarbetet immunoprecipitations tillhandahåller inte kvantifiering i en enda cell upplösning eller information om lokalisering av protein komplex i cellen. Upptäckt av samexistens av protein komplex i en cell eller en cell facket genom immunofluoresence bygger på överlappningen av spridda signaler och därför har låg spatial upplösning och inte kan ge korrekt information om proteininteraktioner. Kvantifiering av immunofluoresence signalen kan göras genom visuell bedömning endast om skillnaden är flera gånger, och kan inte vara korrekt eller mätbara som PLA fläckar. FRET tillåter visualisering av proteinkomplex i levande celler och övervinner behovet av antikroppar och exponeringen av epitop. Beror dock FRET oftast på överuttryck av artificiella smält proteiner, som kanske inte återspeglar det kroppsegna proteinet komplex som i PLA.
Blockering förhållandena i PLA-protokollet är kritiska eftersom antikroppar aggregering kan uppstå och öka bakgrunden. Alternativa blockering villkor finns i ark antikroppen. Lämpliga kontroller med primär och sekundär antikropp underlåtenhet att informera om vad som kan ha gått fel och de måste alltid ingå. Det är viktigt att skärmen olika antikroppar som ger minst bakgrunden när de används ensamma och den bästa signalen när de är tillsammans. Fixering av CELLS är kritisk över uppgjorda kan orsaka proteinkomplex att helt urvattnat och förnedra, medan otillräcklig fixering kan leda till förlust av protein komplex under stegen i förfarandet. Detta kan kontrolleras genom att sänka koncentrationen av fixativ till 3% eller genom att begränsa fixering tiden. Beror dock fixering också på om de primära antikropparna känner igen denatureras proteiner eller inte. Eftersom PLA tekniken är mycket känslig, är särskild försiktighet behövs för att hålla inkubationstiderna och mikro villkor lika mellan olika prover.
Proverna bör inte lämnas att torka i alla fall innan det sista steget. Torkningen av proverna kan leda till ökade bakgrund. Fullständig borttagning av den blockerande lösningen är också viktigt för att undvika bakgrund. Det tvätta buffertar ska alltid föras till rumstemperatur före användning, så låg temperatur saktar den enzymatiska reaktioner. För ytterligare felsökning läsa i manualen i Kit.
Det är bra att använda fläckar att fastställa den sub-cellulära lokalisering av PLA signal (t.ex. DAPI, aktin etc). Här har vi använt DAPI (i monteringsmedium) att färga kärnor. PLA är kompatibel med användningen av immunofluorescens med antikroppar för att bestämma celltyp eller cellulära fack (visas inte här). Exakt kvantifiering kan göras genom att räkna de signaler och användningen av särskild mjukvara (Duolink Image Tool, Olink Biosience).
Sammanfattningsvis har vi visat hur man använder in situ PLA, med hjälp av Duolink kit för att upptäcka BMP signalering i fasta celler och presenterade sina fördelar: lätt att använda, mycket känslig, ingen bakgrund och en unik förmåga att kvantifiera aktiva BMP signalering på plats.
Begränsningen av tillämpningen av denna teknik för att studera olika proteininteraktioner beroende av tillgången och kvaliteten på den primära antikroppar som känner igen de proteiner som undersöks.
Disclosures
Produktionen av denna video-artikeln var sponsrad av Olink som gör ett reagens som används i närheten ligation analysförfarandet.
Acknowledgments
Denna forskning finansieras av MRC och BBSRC bidrag. Vi tackar Agata Zieba och Katerina pardalis i Ulf Landegren labb, Uppsala universitet för att hjälpa till med att inrätta den teknik och användbara råd. Olink Biosience för teknisk hjälp och presentationen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Invitrogen | 21710025 | |
| DMEM | Invitrogen | 21063029 | |
| FBS | AutogenBioclear | 7.01 | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| 16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | |
| Polysine | VWR international | 631-0107 | |
| Cover glass | VWR international | 631-0138 | |
| a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling Technology | 9511 | |
| a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7966 | |
| Dorsomorphin | Merck & Co., Inc. | 171260-10MG | |
| Recombinant Mouse BMP-4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Promega Corp. | H5151 | |
| Duolink II Detection Reagents (Orange) | Olink Bioscience | 92007-0100 | |
| Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | |
| Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | |
| Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | |
| Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |
References
- Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one morphogenetic protein receptors and signal transduction. J Biochem. 147, 35-51 (2010).
- Gustafsdottir, S. M. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).
- Soderberg, O. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).
- Soderberg, O. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
- Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).
- Baan, B. In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo. Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.
- Massinen, S. Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia. Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).
- Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids. Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).
