Tillverkning av Micropatterned Hydrogeler för Neural Kultur System som använder Dynamic Fotolitografi Mask Projection

Summary

Enkla tekniker finns beskrivna för snabb produktion av mikrofabricerade neurala kultur system som använder en digital micromirror device för dynamisk mask projektion litografi på regelbundna substrat cellkultur. Dessa kulturen system kan vara mer representativ för naturliga biologiska arkitektur, och de beskrivna teknikerna skulle kunna anpassas för många tillämpningar.

Abstract

Allt fler mönstrade cellodling miljöer bli en relevant teknik för att studera cellulära egenskaper, och många forskare tror på behovet av 3D-miljöer att representera in vitro-försök som bättre efterliknar in vivo kvaliteter ^1-3. Studier på områden som cancerforskning ^4, neurala ingenjörskonst ^5, hjärt fysiologi ^6, och cell-matrix interaktioner ^7,8 har visat cellens beteende skiljer sig avsevärt mellan traditionella cellslager kulturer och 3D-konstruktioner.

Hydrogeler används som 3D-miljöer på grund av sin mångfald, mångsidighet och förmåga att skräddarsy molekylära sammansättning genom funktionalisering ^9-12. Många olika tekniker finns för skapandet av konstruktioner som cell-stödjande matriser, inklusive electrospinning ^13, elastomer frimärken ^14, bläckstråleutskrifter ^15, additiv photopatterning ^16, statisk fotomasker projektion-litografi ¹⁷ och dynamisk mask microstereolithography ^18. Tyvärr är dessa metoder medför flera produktionssteg och / eller utrustning inte är lätt att anpassa till konventionella celler och vävnader metoder kultur. Tekniken som används i detta protokoll anpassar de två sistnämnda metoderna, med hjälp av en digital micromirror device (DMD) för att skapa dynamiska fotomasker för crosslinking geometriskt specifika poly-(etylenglykol) (PEG) hydrogeler, inducerad genom UV inlett fri radikal polymerisering. Den resulterande "2.5D" strukturer ger ett begränsat 3D-miljö för neural tillväxt. Vi använder en dual-hydrogel tillvägagångssätt, där PEG fungerar som en cell-restriktiv regionen levererar struktur till en annars formlösa men cell-tillåtande självorganiserande gelé från antingen Puramatrix eller agaros. Processen är en sammanfattning enkelt ett steg tillverkning som är mycket reproducerbar och kan enkelt anpassas för användning med konventionella metoder cellkultur och substrat.

Hela vävnad explants, t.ex. embryonala dorsalrotsganglier (DRG), kan införlivas i den dubbla hydrogelen konstruktioner för experimentella analyser som neurite utväxt. Dessutom kan skiljas celler inkapslade i photocrosslinkable eller egen polymerisation hydrogel eller selektivt anslutit sig till genomsläppliga stödja membran med hjälp av cell-restriktiv photopatterning. Med hjälp av DMD skapade vi hydrogel konstruktioner upp till ca 1 mm tjock, men tunn film (<200 mikrometer) var PEG strukturer begränsas av syre härdning av fria radikaler polymerisationsreaktion. Vi utvecklade därefter en teknik som använder ett lager av olja ovanför polymerisation vätska som tillåts tunna polymerisation PEG struktur.

I detta protokoll, beskriver vi ett snabbt skapa 3D-hydrogel system för produktion av mikrofabricerade neurala cell-och vävnadskulturer. Den dubbla hydrogelen visat konstruerar representerar häri mångsidig in vitro-modeller som kan vara användbar för studier i neurovetenskap med cellöverlevnad, migration och / eller neurite tillväxt och vägledning. Eftersom protokollet kan fungera för många typer av hydrogeler och celler, de potentiella tillämpningar är både varierande och omfattande.

Protocol

1. DMD Setup

1. Den DMD ombord, UV-ljus guide (med kollimator) och 4x objektiv är alla monteras vertikalt på en vibrationsisolering bord.
2. UV-ljuset guiden bör justeras så att ljuset träffar spegeln array i en vinkel på 45 ° i förhållande till plan speglar, och 24 ° under plan speglar (Figur 1).
3. Det objektivet monteras så att avståndet från DMD till objektiv motsvarar brännvidden samband med objektivet.
4. Ett inverterat mikroskop sitter under objektiv, så att den fokuserat ljus som reflekteras från DMD kan visualiseras genom mikroskop. Avståndet från objektiv till polymerisation ytan bör ungefär motsvara arbetsavstånd av linsen. Scenen på mikroskopet kan sedan användas för att justera detta avstånd till fint fokusera bilden. Detta avstånd kan variera beroende på valt polymerisation ytan.

2. Dubbla Hydrogel Konstruerar för vävnadskulturer Explantation

A. DRG Explantation vidhäftning

1. Täck väggar av 6-väl kollagen belagda skär cellkultur (Corning) med Rain-X, var noga med att undvika att membranet i sig. (Alternativt kan en hydrofob barriär penna användas.)
2. Hydrate skär över natten med 1,5 ml vidhäftning medium i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO _2. Vidhäftning medium neurobasal medium med 10% fetalt bovint serum, 1% Penicillin / streptomycin, 0.5mm L-glutamin, och 20 mikrogram / ml NGF.
3. Harvest embryonala dorsalrotsganglier (DRG) från E-15 råttungar. DRG bör vara klädd på kollagen bestruket 6-bra insatser, så många som fyra per skär.
4. Inkubera skär i 2 timmar för att möjliggöra DRG anslutning till membranet.

B. Dynamisk mask photopolymerization

En digital Micromirror Device (DMD) är en 1024 x 768 rad enskilda speglar, liknande den i projektion tv-apparater, som selektivt reflekterar ljus baserat på spegeln position. För våra syften är DMD används för att mönstret ultraviolett (UV) ljus på photocrosslinkable hydrogeler, skapa beskrivas hydrogel geometrier på ett enkelt och snabbt sätt. Figur 1 visar installationen av den DMD och UV-ljus stig. Även vår DMD är en fristående enhet, kan enheten även integreras för att användas med många befintliga mikroskop.

1. Ta bort alla överflödig vätska från in och lägga 500 mikroliter för polymerisation medelstora inne i insatsen. Polymerisation medelstora innehåller 10% PEG (MW 1000) och 0,5% Irgacure 2959 upplöstes neurobasal mediet kompletteras med 20 mikrogram / ml NGF och 1% Penna / Strep.
2. Placera insatsen under DMD enheten på en behandlad Rain-X glasskiva.
3. Fyll på rätt svartvit bild som ska användas som en "fotomask" på DMD, med hjälp av den medföljande ALP-3 grundläggande GUI-program. För våra syften, var en bifurcating valda formen för att möjliggöra genomförandet av neurite styrsystem.
4. Med ett inverterat mikroskop för visualisering, rikta vävnaden explants med lämplig plats på fotomasken med en synlig ljuskälla reflekteras från DMD.
5. Slå det synliga ljuset källan för UV-ljuskälla samt belysa PEG lösning tills crosslinking är tillräcklig. (För de villkor som anges och 5,0 watt / cm ² incident på DMD kan crosslinking fyllas i så lite som 55 sekunder.) Upprepa för alla fyra DRG på insatsen.
6. Tvätta varje in tre gånger med sterilt DPBS och 1% Pen-Strep.
7. Tillsätt 1,5 mL odlingsmedium under cellodling inlägg, och låt jämvikt i en kuvös i 30 minuter. Tillväxten medium är neurobasal medium som innehåller 2% B-27, 1% Penna / Strep, 0.5mm L-glutamin, och 20 mikrogram / ml NGF.

C. Sekundär hydrogel

Puramatrix

1. För neuronala tillämpningar är 1% Puramatrix utspädning enligt tillverkarens anvisningar till 0,15% i sterila H ₂ O och kompletteras med 1 mikrogram / ​​ml löslig laminin.
2. Allt överflödigt material måste tas bort från PEG håligheter, som innehåller DRG explants, med en steril applikator bomull spets, Kimwipe, eller mikropipett.
3. Puramatrix läggs till PEG håligheter med en mikropipett för att fylla det tomma utrymmet utan överfyllda. Beroende på residualurinvolym, vanligtvis ~ 1 mikroliter används per konstruktion.
4. Puramatrix börjar processen att självorganisering omedelbart efter kontakt med en fysiologisk saltlösning, dvs svullna PEG, men 1,5 ml odlingsmedium läggs under insatsen och placeras i inkubatorn under en timme för att säkerställa total gelation.
5. Inledningsvis är Puramatrix något sur, så ändrar media efter en timme så att pH till jämvikt.
6. Media förändringar krävs ungefär var 48 timmar. Var försiktig så att alla medier ärläggas under insatsen, för att skydda integriteten av mekaniskt svaga Puramatrix.

Agarosen

1. För neuronala tillämpningar är agaros späds till en 1% lösning i odlingsmedium och placeras i en 60 ° C vattenbad tills agarosen helt löst sig (~ 1 tim). Lösningen är då kompletteras med 1 mikrogram / ml löslig laminin.
2. Allt överflödigt material måste tas bort från PEG håligheter.
3. Agarosen läggs till PEG håligheter för att fylla det tomma utrymmet utan överfyllda. Beroende på volym tomrum, typiskt ~ 1 mikroliter används per konstruktion.
4. 1,5 ml odlingsmedium är pre-kylda (8 ° C) i ett 6-brunnar, och agarosen innehåller bilagor överförs till kyld media och underhålls i kylskåp vid 8 ° C i minst tre minuter för att agarosen till gel.
5. Slutligen är de skär över till 1,5 ml förvärmda odlingsmedium (37 ° C) och upprätthålls i inkubatorn vid 37 ° C, med medier förändringar som krävs för varje 48 timmar.

3. Dubbla Hydrogel 3D Cell Inkapsling

Dubbla hydrogel inkapsling är lämplig när man använder en självorganiserande gel. Den photocrosslinkable gel, i detta fall PEG, fungerar som ett strukturellt stöd till det geometriska presentationen av självordnande gel, till exempel Puramatrix eller agaros. Några av de metoder, särskilt den typ av gel och val av fotomasker, kommer att bero på den önskade viss tillämpning.

1. Ladda en lämplig mask på DMD. För vår ansökan, cellöverlevnad valde vi helt enkelt en cylindrisk presentation av Puramatrix till stöd i avbildning av celler. Forskare studerar cellsignalering kan vara intresserade av ett kompartment-geometri för att möjliggöra spridning av kemotaxi molekyler. Dessutom var en grov uppskattning av en artär visat att representera eventuell ansökan till blodkärl forskning.
2. Behandla väggarna av en polyester cellodling in med Rain-X, och placera under DMD på Rain-X belagda bild.
3. Tillsätt 500 mikroliter för polymerisation medium till insatsen. Framkalla PEG crosslinking av exponering för UV-ljus i 55 sekunder.
4. Tvätta tre gånger med sterilt DPBS och 1% Pen-Strep.
5. Ta bort allt överflödigt material från PEG håligheter.
6. Spinn ner celler vid den önskade tätheten i en pellet. Försiktighet måste vidtas för att ta bort alla medel från cellpelleten före blandning, som Puramatrix börjar självorganisering omedelbart efter kontakt med en saltlösning. Häng celler inuti 0,15% Puramatrix utspätt i steril H ₂ O kompletteras med 10% sackaros.
7. Injicera Puramatrix / cell / sackaros blandning inuti håligheter i PEG.
8. Tillsätt 1,5 ml odlingsmedium under infoga, och låt gelen inuti inkubator för en timme.
9. Ändra media efter en timme, och ~ var 48 timmar därefter.

4. Enstaka Hydrogel 3D Cell Inkapsling

En enda hydrogel inkapsling skulle vara lämpligt för alla situationer där cellerna kan undersökas inne i en photocrosslinkable hydrogel.

1. Ladda en lämplig mask på DMD. För studier cellöverlevnad valde vi återigen en grundläggande cirkulär mask för att representera en cylinder. Masker som liknar de som visas i metod 4 på nytt kan tillämpas för lämplig forskningsområdet.
2. Behandla en polyester sätter cellkultur med Rain-X, och placera under DMD på Rain-X belagda bild.
3. Celler som helst önskad koncentration kan läggas direkt till 10% PEG-lösning, blandning och för att säkerställa homogen fördelning.
4. Tillsätt 500 mikroliter för polymerisation medium till insatsen. Framkalla PEG crosslinking av exponering för UV-ljus i 55 sekunder.
5. Tvätta tre gånger med sterilt DPBS och 1% Pen-Strep.
6. Fyll med odlingsmedium både under och ovanpå insatsen, förändras varje ~ 2 dagar.

5. Thin Film Hydrogel polymerisation

1. Ladda en lämplig mask på DMD.
2. Behandla en kollagen-belagd polyester sätter cellodling med Rain-X, och placera på Rain-X belagda bild.
3. Tillsätt tillräckligt polymerisation medium till bara täcka botten av insatsen (~ 250-300 mikroliter för 6-brunnar skär). Låt media att genomsyra in membranet i 30-45 minuter i rumstemperatur.
4. Ta bort överflödigt polymerisation medium från insatsen med en mikropipett eller Kimwipe. Lägg till en tillräcklig mängd av UV-transparent olja för att helt täcka botten av insatsen. Låt insatsen för att sitta i 15-30 minuter i rumstemperatur, tillräckligt länge för oljan att bilda ett separat lager ovanför polymerisation mediet mättar sätter membranet.
5. Sätt in och glider under DMD. Framkalla PEG crosslinking av exponering för UV-ljus. På grund av den tunna PEG lager kan crosslinking fyllas i så lite som 15 sekunder vid 5,0 watt / cm ² incident på DMD.
6. Förvara in i en 6-väl vävnadskultur plattan. Lägg tillväxt på medellång och suspenderade celler, till önskad koncentration, och pipettera en tillräcklig volym av cellsuspensionen inne i cellodling in för att få önskad celltäthet. Lägg sedan till tillräckligt odlingsmedium under insatsen att helt hålla cellviabiliteten (~ 1,5 ml).
7. Efter 48 timmar har förflutit, tvätta insatsen tre gånger med sterilt DPBS och 1% Pen-Strep att få bort eventuellt unadhered celler. Ändra media ungefär en gång per 48 timmar.

6. Representativa resultat

Exempel på dubbla hydrogel konstruktioner som innehåller DRG explants visas i figur 2. Observera att cellulära migration och neurite förlängning är begränsad till cellen tillåtande regionen av den dubbla hydrogel konstruera. Figur 3 visar dissocierade celler inkapslade liknande inne i dubbla hydrogelen konstruktioner. På grund av den dynamiska karaktären hos DMD fotomasker, är geometrin för inkapsling begränsas bara av dimensioner och upplösning optik. Cell inkapsling var också möjligt inom en enda photopolymerizable hydrogel, PEG, och en levande / döda livskraft test utfördes som framgår i Figur 4. Inkapsling i PEG är tänkt endast som ett exempel, som PEG inte utgör en idealisk miljö för neurala celler. Därför är cellviabiliteten förverkligas i vår PEG konstruerar förståeligt låg. Slutligen, är exempel på att använda tunna PEG filmer som en mönstrad restriktiv lager för cell adhesion på skären cellkultur visas i Figur 5. Dessutom är exempel på möjliga "dåliga" resultat erbjuds i Figur 6.

Resultaten utgör endast en liten del av de möjliga användningsområdena för de metoder som utvecklats i vårt laboratorium. De är avsedda att visa på enkelhet, mångsidighet och livskraften i vår strategi, och kunde behandlas som "proof of principle" för forskare att utveckla sin egen eventuella anpassningar.

Figur 1. Schematisk illustration av ljusstrålen som används för fotolitografiska. Infälld: UV-lampa som lyser upp DMD en vinkel på 45 ° och 24 ° under plan spegel matrisen.

Figur 2. Märkta tillväxt och spridning i DRG innehåller dubbla hydrogel konstruktioner. AD) bilder föreställande polymeriserade PEG konstruktioner (grå) med neurites märkt med Beta III tubulin (grön), DAPI färgade cellkärnor (blå). Den DRG explants finns i Puramatrix och ligger i runda delar av mönster med neurites växer mot bifurkation (s).

Figur 3. Dual hydrogel konstruktioner som innehåller celler märkta med kalcein AM, en levande cell markör, efter 48 timmar i tillväxt medium. AD) Olika PEG former, fyllda med Puramatrix innehåller dissocierade DRG nervceller (~ 5x10 ³ celler / ml).

Figur 4. Singel hydrogel konstruera innehåller levande celler märkta med kalcein AM (grön) och döda celler märkta med Ethidium homodimer-1 (röd) efter 24 timmar i tillväxt medium (5x10 ³ celler / ml).

Figur 5. Cell restriktiva PEG polymeriserade som en tunn film med ett "test mönster" att selektivt hålla dissocierade celler till kollagen belagda membran genomsläppliga stöder. A, B) Levande celler är märkta efter 48 timmar med kalcein AM (grönt), medan döda celler är märkta med Ethidium homodimer-1 (röd). Minimal cell adhesion förekommer i området med den tunna PEG filmen.

Figur 6. Representant bilder av oönskade resultat. A) Partiell polymerisation av PEG, vilket leder till en oanvändbar PEG konstruktion. Felaktig polymerisation kan inträffa på grund av närvaron av en menisk i pre-polymer medium, otillräckliga mängder av polymerisation medium, otillräcklig UV-exponering eller felaktig inriktning av optik. B) Bild föreställande polymeriserade PEG konstruktioner (grå) med neurites märkt med Beta III tubulin (grön), DAPI färgade cellkärnor (blå). Den neurites kunde växa utanför den mönstrade PEG kanaler. Detta sker ofta i det skick som Puramatrix rinner ovanpå PEG del under injektion.

Discussion

Den metod som beskrivs här kan användas av någon utredare som söker enkla och reproducerbara system cellodling. Teoretiskt, på grund av det stora utbudet av photopolymerizable hydrogeler tillgänglig, kan miljön anpassas för att möjliggöra för användning med alla celltyper, inklusive hela vävnad explants. Dessutom ger det dubbla hydrogelen systemet för förbättrad fysisk kontroll i presentationen av själv-polymerisation hydrogeler, som tenderar att bilda amorfa former på egen hand. Den resulterande "2.5D" micropatterned hydrogel konstruktioner ger en 3D-matris för neurala tillväxt som presenteras i en 2D-konfiguration som ger enkel mikroskopisk utvärdering. Underlaget som geler polymeriserat kan också varieras, vilket möjliggör större kontroll i experimentell design. Våra metoder är optimerade för användning med genomträngliga cellodling stödjer, som vi sett förbättrade lönsamheten (Figur 4) jämfört med polymerisation på glas diabilder (data visas inte). Dock kan andra polymerisation ytor vara mer tillämpliga för olika användningsområden: tillverkning på glas bilderna används i mikrofluidik experiment eller cell formationer aggregat, till exempel.

Vår erfarenhet av dessa kultur-system har lett till att identifiera potentiella problemområden. Först är noga med teknik som krävs för att bibehålla sterilitet konstruktioner. På grund av den skrymmande typ av DMD setup, är det svårt att driva polymerisation steg under sterila förhållanden. För att bekämpa detta problem, är skölj steg som beskrivs i de metoder hjälpsamma, och antibiotika bör användas i alla medier. Dessutom är den slutliga tjockleken och formen på polymeriserade bygga starkt beroende av vätska beteende före polymer blandning och närvaron av en menisk kan resultera i gel konstruktioner som är för tunna eller ofullständigt polymeriserade (Figur 6). Två åtgärder kan vidtas för att minimera bildandet av en menisk inne insatser cellkultur. För tjock hydrogeler (> 200 mikrometer), en enkel beläggning av Rain-X runt insidan av insatsen är tillräcklig. Men som kortfattat beskrivs ovan, för tunna konstruktioner (<200 mikrometer), är en olja skikt som krävs för att både minimera menisken och förneka syre härdning av fri radikal polymerisering. Upplösning befanns vara beroende av tjocklek, med en minskning av karaktäristisk storlek insåg med allt tjockare geler. Upplösningen varierade också beroende på om funktionen representerade en positiv eller negativ lättnad i hydrogel. Däremot nådde vi en tillräcklig upplösning för konstruktioner med minsta karaktäristisk storlek på skalan av ~ 100 ìm med enbart mikroskop mål som fokuserar optik.

Försöken har visat att den dubbla hydrogelen konstruktioner som beskrivs här utgör en utmärkt grund för bildandet av grundläggande in-vitro modeller för neurite tillväxt och vägledning. Den micropatterning Tekniken som används är en anpassning av befintliga metoder ^18,19, men vår inställning betonade en enkel att implementera design och var optimerad för produktion av produkter med dubbla hydrogel konstruktioner på skären cellkultur, cellodling insatser var viktiga för att förbättra cellviabiliteten samt som crosslinking runt tidigare anhängare vävnad explants. Omfattningen av visat resultat begränsas av intressen vårt laboratorium, men vi tror att de metoder som beskrivs i denna publikation kommer att vara användbar för forskare söker efter en relativt billig, snabb och lätt att använda metoden för tillverkning av 3D-cellodling modeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Micromirror Device	Texas Instruments	DLPD4X00KIT
Collagen Coated Transwell Permeable Support	Corning	3491	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Polyester Transwell Permable Support	Corning	3412	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000-036
L-glutamine	Invitrogen	25030-164
Nerve Growth Factor	Invitrogen	13257-019
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
B-27 Supplement	Invitrogen	17504-044
DPBS	Invitrogen	14190-250
Puramatrix	BD Biosciences	354250
PEG 1000	Polysciences, Inc.	15178
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals	0298913AB
Oil	Have used both canola oil and silicon oil		Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation
OmniCure Series 1000	EXFO
Rain-X