Summary
Dieser Artikel beschreibt eine elektrophysiologische Methode zur Isolierung chemische Stimulation einzelner Sensillen via extrazelluläre, tip-Aufnahmen unter Mineralöl.
Abstract
Wir beschreiben eine Änderung einer bestehenden tip-Aufnahmetechnik 1,2 für elektrophysiologisch untersucht kurzen, zapfenförmigen sensorischen Sensillen 3,4. Auf der Mitte der ventralen Oberfläche aller Skorpione sind zwei Anhängsel namens Pektine, die dichten Bereichen haben mechano-und chemosensorischen peg Sensillen 5,6. Eine Methode zur Beurteilung chemoresponsiveness dieser Sensillen verwendet eine Wolfram-Elektrode für extrazellulär Aufnahme neuronaler Aktivität innerhalb eines Sensillum als flüchtige Riechstoff der sensorischen Bereich 5,7 eingeführt wird. Die Grenzen dieser Methode sind langsame Datensammlung und unkontrollierte Stimulans Einführung und Entnahme aus der Zapfen Feld. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir einen neuen Tipp-Aufnahmetechnik, dass unpolare Mineralöl als Medium, durch die Wasser-Basis Geschmacksstoffe zu einzelnen peg Sensillen 8,9 zu liefern. Wir haben erfolgreich diese Methode angewendet, um sensillar chemoresponses Zitronensäure, Ethanol und Salz zu erhalten. Hier beschreiben wir die experimentelle Protokoll für eine solche Studie 9. Wir denken, diese neue Methode kann nützlich sein für die Untersuchung der Reaktion Eigenschaften von anderen Arthropoden chemosensorischen-Systeme einschließlich derer von Insekten 10, 11 und Krebstiere 12.
Protocol
1. Pre-Recording, Live Animal Vorbereitung
- Entfernen Sie den Skorpion aus dem Hause Krug und legen Sie sie in einem vorgekühlten Glasbehälter; nächstes legen Sie die jar mit dem Skorpion in einen kalten Umgebung (-5 ° C) für mindestens zwei Minuten. Diese Zeit kann je nach Alter unterschiedlich, Größe, Art, etc. der spezifischen Skorpion untersuchten. Aber im Allgemeinen ist das Einfrieren Umwelt-Phase abgeschlossen, wenn das Tier regungslos.
- Nach zwei Minuten wird das immobilisierte Skorpion aus dem kalten Glas-Container, und legen Sie sie Bauchseite bis auf einen Objektträger. Sichern Sie den Stachel, Schwanz, Beine und Pedipalpen mit formbaren Ton (auf Ölbasis, Van Aken Plastalina).
- Machen Sie eine Plattform, auf der der Skorpion ist Pektine kannst. Stellen Sie die Plattform der Länge und Breite je nach Größe des pecten. In der Regel sind unsere Plattformen von Mikroskop Deckglas gebaut und sind ca. 10 (L) x 18 (W) mm.
- Beachten doppelseitigen Klebeband auf die pecten Plattform, Trimmen des Bandes (falls notwendig) zu montieren.
- Um eine pectinal Kammer, legte drei der Plattform vier Seiten in pre-geschmolzenes Wachs (wir verwenden 100% Bienenwachs-Chips) auf eine Tiefe von 3-4 mm. Wir schmelzen das Wachs, indem sie die Chips in einer Glas-Petrischale, auf einer heißen Platte entfernt. Wenn das Wachs an den Rändern der pectinal Kammer auf Raumtemperatur abgekühlt ist, sollte diese Wände aus Wachs ca. 1 mm hohen erstellen.
- Auf das Tier, suchen Sie den Punkt pectinal Einfügen, und legen Sie die un-gewachst Rand der Plattform (Bandseite-up) direkt hinter sie. Danach Stabilisierung der Plattform (so dass es später nicht mehr bewegen) durch leichten Druck seiner rechten und linken peripheren Kanten gegen den Lehm verwendet, um die Beine des Tieres zu beschränken.
- Verwenden Sie spitzen Pinzette vorsichtig die pecten oder Pektine in der Kammer. Genauer gesagt, mit einer Pinzette, halten Sie die pecten entlang der pectinal Wirbelsäule und sanft bringen pecten nicht unterhalb der Glasabdeckung und senken Sie es auf den Klebstoff-Plattform Boden. Stellen Sie eine pecten-to-Tape-Bindung durch eine sorgfältige Anwendung von Druck auf die pectinal Wirbelsäule.
- Jetzt bewerben geschmolzenes Wachs (wir verwenden eine vorgewärmte Metallspatel), um die un-gewachst Rand der Plattform. Der Zweck ist zwei-fach, die pecten zu sichern und vollständig umschließen die Kammer für zukünftige Mineralöl Einführung. Vorsicht beim Auftragen des Wachses über das Tier pecten, wie es möglich ist, die pecten mit Wachs zu heiß ist beschädigt.
- Die pecten Kammer-Konstruktion abgeschlossen ist. Als nächstes gründen eine indifferente Elektrode Zusammenhang mit dem Tier Hämolymphe durch Einfügen eines Silberdraht zwischen zwei Heck-Segmente.
2. Gleichzeitige Aufnahme und extrazelluläre chemische Stimulation
- Wir bereiten das Tier 24 h vor der Durchführung extrazellulären, tip-Aufnahmen, die unter anderen Gründen (zB Tier-Anpassung an die feste Position) ermöglicht Zeit, um individuell zu Stimulans Pipetten einer bestimmten (Sensillum-abhängig) Tip-Durchmesser. Wir verwenden eine Mikropipette Abzieher für die Erreichung dieser Vorgaben. Im Idealfall ist der Durchmesser der Pipetten ≈ 2 pm größer als die sensillar Porendurchmesser. Wir passen unsere Mikropipette Spezifikationen entsprechend für jedes Tier.
- 1 h vor der Aufnahme, fügen wir 5 ul Mineralöl auf die pectinal Kammer, das Eintauchen des pecten unter Öl. Dann positionieren wir das Tier unter einem Hochleistungs-Mikroskop, das lange gearbeitet hat Objektive und Auflicht.
- Um chemisch anzuregen peg Sensillen stellen wir wässrigen Geschmacksstoffe (zB Zitronensäure und Salz) durch das Öl Medium. Erstens verwenden wir eine Mikropipette Füllstoff zur Stimulans in die Stimulans Pipette injiziert. Hinweis: Alle Stimulans Lösungen sollten ein Elektrolyt für die elektrische Leitfähigkeit enthalten.
- Als nächstes wird nach der Positionierung des Stimulans Pipette auf einem Mikromanipulator (in der Aufnahme rig), legen Sie die Aufnahme-Elektrode in die stumpfe, offene Ende des Stimulans Pipette. Es ist wichtig, den Kontakt zwischen der metallischen Elektrode und Elektrolyt-stimulierende Lösung zu gewährleisten.
- Nach der Vorbereitung ist geerdet (über die indifferente Elektrode), einfach wieder senkt die Pipette durch das Öl mittel-und auf eine sensillar Pore. Die Dauer der chemischen Stimulation pro pectinal Sensillum kann von so viel wie 30 Minuten, um so wenig wie 1 Sekunde variieren. Im Allgemeinen können wir Probe mehrere Stifte (> 30) pro Pipette. Für den Fall, dass die stimulierende Pipette verstopft mit winzigen Schmutz wird, ersetzen Sie einfach die verstopfte Pipette für eine neue, unbenutzte Pipette.
3. Vorbereitung eines Tier für mehrere Tage der Experimente
- Wenn das Tier über einen längeren Zeitraum verwendet werden, empfehlen wir die Wiederverwendung der pectinal Kammer und Austausch der Tropfen Mineralöl für jede Aufnahme-Session. Nach einem bestimmten Tag der Aufnahme-Session beendet ist, entfernen Sie das Tier von der Recording-, und führen Sie ein Mineralöl zu waschen.
- Specifically, fügen Sie einen Tropfen (5 ul) von Mineralöl in die Kammer, und alles Öl. Dies minimiert die Gegenwart von restlichem Stimulans, die aus der Pipette kann zugespielt haben während der Aufzeichnung.
- Vor der nächsten Sitzung einen Tropfen Öl wie zuvor beschrieben.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Je nach dem Kontrollgerät verwendet werden (zB die besondere Verstärker, Digitalisierungs-Hardware, etc.), ist ein repräsentatives Ergebnis einer extrazellulären Aufnahme mit einem S: N-Verhältnis von mindestens 3:1.
Erfolgreiche Bau der Mineralöl-Kammer ist notwendig für die Isolierung chemische Stimulation einzelner Sensillen, da sie ein Medium für die Bereitstellung von polaren (Wasser-) chemischen Geschmacksstoffe 8 bietet. Wenn es zu wenig Öl oder gar keine, wird der stimulierende Lösung aus den aufgezeichneten Sensillum zu seinen benachbarten Sensillen, die zu einem länger anhaltenden, unkontrollierten Anfall von chemischen Stimulation 8 Ursache zu verbreiten.
Discussion
Das Protokoll über beschrieben, wie eine Wüste Grünland Skorpion (Paruroctonus utahensis) für elektrophysiologische Untersuchung vorzubereiten. Insbesondere zeigen wir, wie eine Kammer für die kontrollierte extrazelluläre tip-Aufnahmen von pectinal chemosensorischen Neuronen unter Öl zu bauen. Da Öl und Wasser nicht mischen, ist es möglich, chemische Stimulation (mit Wasser-basierte Stimulanzien) zu einzelnen Sensillen zu isolieren. Es sollte betont werden, dass P. utahensis, ist ein relativ kleines Tier (≈ 2,5-5 cm) und die Anwendung dieses Protokolls, um größere Tiere können viele size Anpassungen, wie zB die Größe des Tieres Plattform-, Kammer-und Ölmenge angewandt erfordern. Wir empfehlen Pilotstudien, die minimale Menge an Öl, die für kontrollierte Abgabe von Wasser-basierte chemische Stimulanzien testen.
Darüber hinaus fanden wir keinen Einfluss von Öl auf der Grundlinie neuronale Aktivität innerhalb pectinal Sensillen 8. Dies sollte für andere Modellsysteme bestätigt auch sein, vor der Beurteilung chemoresponsiveness.
Diese Methode kann in Verbindung mit einer anderen Methode zur chemoresponse Wechselwirkungen zwischen den Sensillen in der sensorischen Feldtest eingesetzt werden. Zum Beispiel ist es möglich, tip-Record (unter Öl) von einem Sensillum wie wir Basis-Datensatz (über eine Wolfram-Elektrode) aus einem benachbarten Sensillum 9. Eine solche Aufnahme-Konfiguration verwendet werden, um festzustellen, ob auch chemisch nicht stimulierend Sensillum beeinflusst die neuronale Aktivität der Basis-recorded Sensillum werden. Bis heute hat niemand diese für scorpion pectinal Sensillen getestet, und es bleibt eine offene Frage für andere chemosensorischen Systemen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir die Spitze-Recording-Methode unter Öl Fortschritte Rahmen der elektrophysiologischen Untersuchungen der neuronalen Basis von Arthropoden gustation. In diesem Manuskript, bieten wir ein Protokoll für die Vorbereitung Tiere für diese Methode, und wir hoffen, es bietet eine solide Grundlage für weitere Untersuchungen der peripheren sensorischen Nervensystem.
Disclosures
Wir haben bereits diese Methoden in beiden Zeitschriften Knowlton und Gaffin (2009) and Knowlton und Gaffin (in press) veröffentlicht.
Acknowledgments
Wir danken dem Leben finanzieren, University of Oklahoma Undergraduate Research Opportunities Program, und dem Department of Zoology für die Finanzierung dieser Arbeit. Wir danken auch Dr. Mariëlle Hoefnagels für redaktionelle Hilfe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
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