Summary
この記事では、ミネラルオイル下外、先端録音を経由して個々の感覚器に化学的刺激を単離するための電気生理学的方法を説明します。
Abstract
我々は、電気生理学的に短く、ペグのような感覚感覚器3,4を調査するため、既存の先端記録技術の1,2の変更を説明します。すべてのサソリの半ば腹側表面にメカノと化学的感覚ペグ感覚器5,6の密なフィールドがあるpectinesという二つの付属です。これらの感覚器のchemoresponsivenessを評価するための一つの方法は、揮発性の匂いが感覚フィールド5,7に導入される細胞外に感覚子内の神経活動を記録するためのタングステン電極を使用しています。この方法の制限は、低速なデータ収集と制御されていない刺激の導入、そしてペグのフィールドからの削除などがあります。これらの制限を克服するために、我々は、個々のpeg感覚器8,9に水ベースのtastantsを提供を通す媒体として非極性鉱物油を使用する新しい先端記録技術を開発した。我々は成功し、クエン酸、エタノール、および塩にsensillar chemoresponsesを取得するためにこのメソッドを適用している。ここではそのような研究9の実験的なプロトコルについて説明します。我々はこの新しい方法は昆虫10、11、甲殻類12のものも含めて他の節足動物化学的感覚のシステムの応答特性を研究するために有用かもしれないと思う。
Protocol
1。プリレコーディング、ライブアニマル準備
- そのホームの瓶からサソリを削除し、あらかじめ冷却したガラス容器に入れて、次に、2分間の最低凍結環境（-5℃）にサソリを含むjarファイルを置きます。この時間は、年齢、サイズ、種類、研究の下で特定のサソリの等に応じて異なる場合があります。動物は動かずになるとしかし、一般的に、凍結環境フェーズは完了です。
- 2分後、冷たいガラス容器から固定化サソリを削除し、顕微鏡スライド上に腹側を上に置きます。スティンガー、尾、足、および成形可能な粘土（油ベース、バンアーケンPlastalina）とpedipalpsを固定します。
- サソリのpectinesを置くためのプラットフォームを作る。櫛の大きさに応じて、プラットフォームの長さと幅を調整します。一般的に、私たちのプラットフォームは、顕微鏡のカバーガラスで作られたと約10（L）X 18（W）mmであるされています。
- に合わせてテープを（必要に応じて）トリミング、ホタテガイプラットフォームに両面粘着テープを付着する。
- pectinalチャンバーを作るために、3〜4 mmの深さに予備溶融ワックス（我々は100％蜜蝋のチップを使用）に、プラットフォームの四辺のうち3つを置く。私たちは、ホットプレート上にあるガラスのペトリ皿内でチップを配置することにより、ワックスを溶かす。 pectinal室の端のワックスが室温に冷却されると、これは高さ1 mm程度のワックスの壁を作成する必要があります。
- 動物では、pectinal挿入のポイントを見つけ、そしてそれにちょうど後方のプラットフォームのアンワックスエッジ（テープ側を上に）配置します。その後、ゆっくりと動物の脚を抑制するために使用される粘土に対してその左右の周縁を押して、プラットフォームを（それは後で移動することがないように）安定する。
- チャンバー内の櫛またはpectinesを慎重に配置する先の細いピンセットを使用してください。具体的には、鉗子を使用して、pectinal背骨に沿って櫛状突起を押したまま、ゆっくりとカバーガラスの下から櫛状突起を引き出すと接着プラットフォームの床に下ろします。慎重にpectinal背骨に圧力を適用することにより、ホタテガイからテープへの結合を確立する。
- 現在のプラットフォームのアンワックスエッジに溶けたワックスを（我々は予備加熱された金属製のへらを使って）適用する。目的は、櫛を確保し、完全に将来の鉱物油を導入するためのチャンバーを囲むために、2つあります。それが過熱してワックスで櫛状突起を破損することが可能であるとして、動物の櫛状突起上のワックスを適用するときは注意してください。
- 櫛室の建設は完了です。次に、2つのテールセグメントの間に銀線を挿入することにより、動物の血リンパと不関電極の接続を確立する。
2。同時細胞外記録法と化学的刺激
- 我々は細胞外、先端録音を行う前に動物の24時間を準備し、これは、他の理由（固定位置まで、すなわち動物の調整）の間で、特定の（感覚子に依存する）先端径のカスタムメイクの刺激のピペットに時間が可能になります。我々はそのような仕様を達成するためにマイクロピペットプラーを使用してください。理想的には、ピペットの直径はsensillar細孔径より≈が2μmより大きいです。私たちは、それぞれの動物のためにそれに応じて私たちのマイクロピペットの仕様を調整する。
- 記録前の1時間は、我々は、石油で櫛状突起を水没、pectinal室にミネラルオイルを5μlを加える。その後、我々は、長距離の目標と落射照明を行っていると高倍率の顕微鏡、下に動物を配置します。
- 化学的にペグ感覚器を刺激するために、我々は、石油の媒体を介して水味物質（すなわちクエン酸と塩）を紹介します。最初に、我々は興奮剤のピペットに興奮剤を注入するマイクロピペットフィラーを使用してください。注：すべての刺激のソリューションは、電気伝導度のための電解質が含まれている必要があります。
- 次に、マイクロマニピュレータ（記録のリグで）で覚せい剤のピペットを配置した後、刺激のピペットの鈍い、開放端に記録電極を挿入する。金属電極と電解刺激のソリューションとの間の接触を確保することが重要です。
- 準備が電気的に（不関電極を介して）に接地されると、単純に油媒体を介してとsensillar孔上にピペットを下げます。 pectinal感覚子あたりの化学的刺激の持続時間は同じくらい30回分から、わずか1秒に変えることができます。一般的に、我々は、ピペットごとに複数のペグ（> 30）をサンプリングすることができます。覚せい剤のピペットは分破片で目詰まりした場合に、単に新しい、未使用のピペット用詰まったピペットを交換する。
3。実験の数日に動物を準備
- 動物が長期間にわたって使用する場合、我々はpectinalチャンバーを再利用し、各レコーディングセッションのために鉱物油の滴を置き換えることをお勧めします。ある特定の日のレコーディングセッションが完了したら、セットアップの記録から動物を削除し、鉱物油の洗浄を行います。
- 仕様fically、チャンバーにミネラルオイルの別のドロップ（5μl）を追加し、すべての油を取り除く。これは、記録セッション中にピペットから漏れた可能性がある残留刺激の存在を、最小限に抑えることができます。
- 次のセッションの前に、前述のように石油の一滴を追加。
4。代表的な結果：
少なくとも3:1のN比：（特定のアンプを、例えば、ハードウェア、等をデジタル化する）使用する記録装置に応じて、代表的な結果は、Sと細胞外記録です。
それは極性（水ベース）化学物質の味物質8を提供するための培地を提供するので、鉱物油室の成功の建設は、個々の感覚器に化学的刺激を単離するために必要です。すべてにおいてあまりにも少量の油またはnoneがある場合は、刺激のソリューションは、化学的刺激8の長期、制御されていない試合を引き起こす可能性があるか、その近隣の感覚器に記録された感覚子から広がっていく。
Discussion
上記のプロトコルは、電気生理学的研究のために砂漠草原サソリ（Paruroctonus utahensisを ）準備する方法について説明します。具体的には、油の下にpectinal化学感覚ニューロンの制御された細胞外の先端 - 記録用チャンバーを構築する方法を示します。油と水が混合しないため、単一の感覚器に化学的刺激を（水ベースの刺激剤との）分離することが可能です。それは、P.ことを強調しておきたいutahensis、比較的小さな動物（≈2.5〜5センチメートル）であり、より大きな動物にこのプロトコルを適用すると、このような動物のプラットフォーム、チャンバー、および適用される油の量の大きさなど、多くのサイズの調整を必要とする可能性があります。我々は、水ベースの化学覚せい剤の制御された送達のために必要な油の最少量をテストするパイロット研究を実施することをお勧めします。
さらに、我々はpectinal感覚器8内のベースラインの神経活動のオイルの効果は認められなかった。この前chemoresponsivenessを評価するだけでなく、他のモデルシステムのために確認されるべきである。
このメソッドは、感覚分野における感覚器の間でchemoresponse相互作用の効果をテストする別の方法と組み合わせて使用することができます。例えば、それは近隣の感覚子9から我々のベースレコード（タングステン電極を介して）として1つの感覚子からtip -記録（油下）に可能です。このような記録の構成は、化学的にone感覚子を刺激しているかどうかを評価するために使用することがベースに記録された感覚子の神経活動に影響を与えます。これまでに、誰もサソリpectinal感覚器のためにこれをテストしていない、そしてそれは同様に他の化学的感覚のシステムの未解決の問題のまま。
要約すると、我々は、石油の進歩節足動物味覚の神経基盤に電気生理学的研究の範囲で先端の記録方法を考える。この原稿では、我々はこの方法のために動物を準備するためのプロトコルを提供し、我々はそれが末梢感覚神経系のさらなる研究のための確固たる基盤を提供する願っています。
Disclosures
我々は、これまでの2誌、ノウルトンとGaffin（2009）とノウルトンとGaffin（印刷中）でこれらのメソッドを公開しています。
Acknowledgments
我々は生命のファンド、オクラホマ大学学部研究機会プログラム、およびこの作業に資金を提供するための動物の部に感謝。我々はまた、編集のヘルプは博士マリエルのHoefnagelsに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a Primary Chemoreceptor unit. Science. 12, 417-418 (1955).
- Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).
- Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla. Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).
- Carthy, J. D. Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten. Experientia. 22, 89-91 (1966).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions. J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).
- Wolf, H. The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections. Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines. J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique. J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants. J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Haupt, S. S. Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology. J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).
- Bland, R. G. Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).
- Cate, H. S., Derby, C. D. Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum. J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).
