Summary
Bu makale, mineral yağ altında ekstrasellüler, ucu kayıtları üzerinden bireysel sensilla kimyasal stimülasyon izole bir elektrofizyolojik yöntem açıklanır.
Abstract
Biz, kısa, duyusal sensilla 3,4 tahta gibi elektrofizyolojik araştırmak için, mevcut bir ucu kayıt tekniği 1,2 bir değişiklik açıklar. Bütün akrepler orta-ventral yüzey üzerinde yoğun alanlar var pektinler olarak adlandırılan iki ekleri, mekanik ve kimyasal-duyusal peg sensilla 5,6 . Bu sensilla chemoresponsiveness değerlendirilmesi için bir yöntem uçucu odorant duyusal alanında 5,7 olarak ekstraselüler sensillum içinde nöral aktiviteyi kayıt için bir tungsten elektrot kullanır. Bu yöntemin sınırlarını yavaş veri toplama ve kontrolsüz uyarıcı giriş ve Hazır Giyim alanında, kaldırılması içerir. Bu sınırlamaları aşmak için, biz, bireysel peg sensilla 8,9 su bazlı tastants sunmak için bir araç olarak apolar madeni yağ kullanan yeni bir ucu kayıt tekniği geliştirdi . Biz başarıyla sensillar chemoresponses, sitrik asit, etanol, ve tuz elde etmek için bu yöntemi uyguladık. Burada, böyle bir çalışma 9 için deney protokolünde açıklar . Biz bu yeni yöntem, bu böcekler 10, 11 ve 12 kabuklular de dahil olmak üzere diğer eklembacaklı kimyasal-duyusal sistemleri, tepki özelliklerini inceleyerek için yararlı olabilir düşünüyorum .
Protocol
1. Ön-kayıt, Canlı Hayvan Hazırlığı
- Kendi ev kavanoz akrep çıkarın ve önceden soğutulmuş bir cam kaba koyun; yanında, donmuş bir ortamda (-5 ° C) en az iki dakika akrep içeren kavanoza yerleştirin. Bu sefer yaşına göre değişebilir, boyut, çalışmanın altında özel akrep türleri, vb. Ama genelde hayvan hareketsiz bir kez, donma çevre aşaması tamamlandıktan.
- İki dakika sonra, soğuk cam kap immobilize akrep kaldırmak ve bir mikroskop lamı üzerine ventral tarafta bir yerin. Stinger, kuyruk, bacak, ve moldable kil (yağ bazlı, Van Aken Plastalina) pedipalps sabitleyin.
- Akrep pektinler koymak için bir platform olun. Platformu uzunluk ve genişlik Pecten boyutuna göre ayarlayın. Tipik olarak, bizim platformları mikroskop kapak camdan inşa edilmiş ve yaklaşık 10 (L) X 18 (W) mm.
- Sığacak şekilde (gerekirse) bant kırparak Pecten platformu için çift taraflı yapışkan bant uyun.
- Pectinal odasına yapmak için, önceden eritilmiş balmumu içine (% 100 balmumu yongaları kullanan), 3-4 mm derinliğe kadar platformun dört tarafı üç koymak. Biz sıcak bir plaka üzerinde bulunan bir cam petri içinde çipler yerleştirerek balmumu eritebilir. Pectinal odasının kenarlarında balmumu oda sıcaklığına kadar soğutulur sonra, bu yüksek yaklaşık 1 mm balmumu duvarları oluşturmanız gerekir.
- Hayvan, pectinal ekleme noktasını bulun ve sadece arka platform un-mumlu kenarı (bant yan-up) yerleştirin. Daha sonra, hayvanın bacakları dizginlemek için kullanılan kil karşı sağ ve sol periferik kenarları hafifçe basarak platformu (daha sonra üzerinde hareket olmaz böylece) stabilize.
- Odanın içinde Pecten veya pektinler dikkatli bir şekilde yerleştirmek için ince uçlu forseps kullanın. Özellikle, forseps kullanarak, pectinal omurga boyunca Pecten tutun ve yavaşça Pecten cam kapak altından çıkarmak ve yapışkan bir platform zemine daha düşük. Pectinal omurga dikkatlice basınç uygulayarak bir Pecten-kaset bağının kurulması.
- Şimdi, platformun un-mumlu kenarına erimiş mum (önceden ısıtılmış bir metal spatula kullanın) geçerlidir. Pecten amacı güvenli ve tam geleceğin madeni yağ tanıtımı için oda içine iki yönlüdür. Çok sıcak balmumu ile Pecten zarar mümkün olduğu gibi, hayvanın Pecten üzerinde balmumu uygularken dikkatli kullanın.
- Pecten odasının inşaat tamamlandı. Sonra, iki kuyruk segmentleri arasındaki gümüş tel takarak hayvan hemolimf kayıtsız bir elektrot bağlantı kurmak.
2. Eşzamanlı Ekstrasellüler Kayıt ve kimyasal stimülasyon
- Biz diğer nedenleri arasında (yani sabit bir pozisyonda hayvan ayarı), izin verir, ekstrasellüler, ucu kayıtları yapmak için hayvan 24 saat önce hazırlamak için zaman özel belirli bir (bağımlı sensillum) tip-çapı uyarıcı pipetler. Biz bu tür özellikleri elde etmek için bir mikropipet çektirmesi kullanın. İdeal olarak, pipetler çapı ≈ 2 mikron sensillar gözenek çapı daha büyüktür. Biz her bir hayvan için mikropipet özellikleri buna göre ayarlayın.
- Kayıttan önce 1 saat, biz, petrol altında Pecten daldırarak pectinal odasına 5 ul mineral yağ ekleyin. Sonra, uzun mesafe hedefleri ve epi-aydınlatma çalışan bir yüksek güçlü mikroskop altında hayvan yerleştirin.
- Kimyasal dübel sensilla teşvik etmek, sulu tastants (örneğin sitrik asit ve tuz) petrol aracılığıyla tanıtmak. İlk olarak, uyarıcı, uyarıcı pipet içine enjekte etmek için bir mikropipet dolgu kullanın. Not: Tüm uyarıcı çözümler elektriksel iletkenlik için bir elektrolit içermelidir.
- Sonra, bir micromanipulator (kayıt teçhizat) uyarıcı pipet konumlandırma sonra kayıt elektrot uyarıcı pipet künt, açık ucunu yerleştirin. Metal elektrot arasındaki temas ve elektrolitik uyarıcı bir çözüm sağlamak için önemlidir.
- Hazırlık elektriksel petrol aracılığıyla ve bir sensillar gözenek üzerine pipet, sadece düşük (kayıtsız elektrot aracılığıyla) topraklanmış. Pectinal sensillum başına kimyasal stimülasyon süresi kadar otuz dakika gibi kısa bir sürede ikinci değişebilir. Genellikle, pipet başına birden fazla mandalları (> 30) tadabilirsiniz. Uyarıcı pipet dakika enkaz ile tıkanmış hale gelmesi durumunda, yeni, kullanılmamış bir pipet tıkanmış pipet değişimi.
3. Hayvan Deneyleri Çoklu Günler için hazırlanması
- Hayvan uzun bir süre boyunca kullanılmak üzere ise, pectinal odasının yeniden ve her kayıt oturumu için mineral yağ damla yerine öneririz. , Belirli bir günde kayıt işlemi tamamlandıktan sonra, kayıt set-up hayvan çıkarın ve bir madeni yağ yıkama yapın.
- Specifically, mineral yağ, başka bir odaya açılan (5 ul) ekleyin ve tüm petrol çıkarmak. Bu kayıt oturumu sırasında pipetin dışarı sızdırılmış olabilir kalıntı uyarıcı, varlığı en aza indirmeye yardımcı olur.
- Sonraki oturumda önce, daha önce açıklandığı gibi bir damla yağ ekleyebilirsiniz.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
N oranı en az 3:1 kayıt ekipmanları (özellikle amplifikatör gibi, sayısallaştırma donanım, vb.) Bağlı olarak, temsili bir sonuç S ile ekstraselüler kayıt.
Başarılı yapım, mineral yağ haznesi, kimyasal uyarımı bireysel sensilla izole için gerekli olan polar (su bazlı) kimyasal tastants 8 sağlamak için bir ortam sağlar . Çok az yağ ya da hiç yoksa, uyarıcı bir çözüm, uzun bir kimyasal stimülasyon 8, kontrolsüz bir maçı neden olabilecek komşu sensilla kaydedilen sensillum yayılacaktır.
Discussion
Yukarıdaki protokol elektrofizyolojik çalışma için bir çöl otlak akrep (Paruroctonus utahensis) nasıl hazırlanacağını açıklar. Özellikle, biz altında pectinal yağ kimyasal-duyusal nöronların kontrollü ekstrasellüler ucu kayıtları için nasıl bir oda inşa göstermektedir. Yağ ve su karışmaz, çünkü kimyasal stimülasyon (su bazlı uyarıcılar ile) tek sensilla izole etmek mümkündür. Vurgulamak gerekir ki, P. utahensis, görece küçük bir hayvan (≈ 2.5-5 cm) ve büyük hayvanların bu protokolü uygulayarak hayvanın platformu, odanın boyutu gibi birçok boyutu ayarlamaları ve uygulanan yağ miktarı gerekebilir. Biz su bazlı kimyasal uyarıcıların kontrollü teslimat için gerekli minimum miktarda yağ test etmek için pilot çalışmalar yapmanızı öneririz.
Ayrıca, yağ içinde pectinal sensilla 8 temel sinir aktivitesi üzerinde herhangi bir etkisi bulundu. Bu önce chemoresponsiveness değerlendirirken, aynı zamanda diğer model sistemler için teyit edilmelidir.
Bu yöntem chemoresponse duyusal alanında sensilla arasında etkileşim etkileri test etmek için başka bir yöntem ile birlikte kullanılabilir. Örneğin, bir sensillum ucu-record (yağ altında) mümkün olduğu gibi biz komşu bir sensillum 9 baz kayıt (tungsten elektrod aracılığıyla). Böyle bir kayıt yapılandırma tabanına kaydedilmiş sensillum nöral aktivitenin etkiler olsun ya da kimyasal bir sensillum uyarıcı değerlendirmek için kullanılıyor olabilir. Bugüne kadar hiç kimse bu akrep pectinal sensilla test etmiş ve bunun yanı sıra diğer kimyasal-duyusal sistemleri için açık bir soru kalır.
Özetlemek gerekirse, biz, petrol gelişmeler eklembacaklı tadında nöral temeli haline elektrofizyolojik araştırmalar kapsamı altında ucu-kayıt yöntemi düşünüyorum. Bu yazıda, biz bu yöntem için hayvan hazırlamak için bir protokol sağlamak ve periferik duyusal sinir sistemi daha fazla çalışma için sağlam bir temel sağlar umuyoruz.
Disclosures
Biz daha önce iki dergi, Knowlton ve Gaffin (2009) ve Knowlton ve Gaffin (baskıda) bu yöntemlerin yayınlandı.
Acknowledgments
Biz Life fonu, Oklahoma Üniversitesi Lisans Eğitim ve Araştırma Olanakları Programı, ve bu işi finanse etmek için Zooloji Bölümü teşekkür ederim. Ayrıca Dr. Marielle Hoefnagels editoryal yardım için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a Primary Chemoreceptor unit. Science. 12, 417-418 (1955).
- Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).
- Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla. Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).
- Carthy, J. D. Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten. Experientia. 22, 89-91 (1966).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions. J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).
- Wolf, H. The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections. Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines. J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique. J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants. J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Haupt, S. S. Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology. J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).
- Bland, R. G. Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).
- Cate, H. S., Derby, C. D. Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum. J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).
