Summary
نقدم العامة موقع على شبكة الإنترنت الحاسوبية لتحليل تسلسل الجيني. يكشف تسلسل الحمض النووي مع أنماط التراكيب غير عشوائية مختلف النوكليوتيدات. يولد هذا المورد أيضا تسلسل عشوائية مع مستويات مختلفة من التعقيد.
Abstract
غير الترميز مناطق الجينوم في حقيقيات النواة المعقدة ، بما في ذلك المناطق بين الجينات ، الإنترونات ، وشرائح غير مترجمة من exons متماثلة ، هي سياسات مغرقة في غير عشوائية في تكوينها النوكليوتيدات وتتألف من فسيفساء معقدة من أنماط التسلسل. هذه الأنماط تشمل ما يسمى متوسط التجانس (MRI) المناطق -- 3-10 متواليات النيوكليوتيدات في الطول التي يثريها قاعدة معينة أو مجموعة من قواعد (على سبيل المثال (G + T) الغنية ، الغنية البيورين ، الخ. ). وترتبط مناطق التصوير بالرنين المغناطيسي مع الهياكل الحمض النووي غير عادية (غير شكل B -) التي غالبا ما تشارك في تنظيم التعبير الجيني ، إعادة التركيب ، والعمليات الجينية الأخرى (Fedorova فيدوروف و 2010). وجود تحيز التثبيت القوي داخل المناطق MRI ضد الطفرات التي تميل إلى خفض التجانس على تسلسل تؤيد وبالاضافة الى وظائف وأهمية هذه متواليات الجينوم (براكاش وآخرون 2009).
نحن هنا يبرهن على وجود موارد الإنترنت متاحة بحرية -- في حزمة برنامج الجينوم التصوير بالرنين المغناطيسي -- (بكتل وآخرون 2008) المصممة لتحليل تسلسل الجينوم الحسابية من أجل العثور على التصوير بالرنين المغناطيسي وتوصيف أنماط مختلفة داخلها. هذه الحزمة تسمح أيضا توليد متواليات عشوائية ذات الخصائص المختلفة ، ومستوى المراسلات لتسلسل الحمض النووي المدخلات الطبيعية. الهدف الرئيسي لهذا المورد هو تسهيل فحص مناطق واسعة من ال DNA غير المشفرة التي لا تزال تنتظر التحقيق والتنقيب بالكاد شامل والاعتراف بها.
Protocol
وقد كتبت جميع البرامج المستخدمة في ورقة باستخدام بيرل ، كما تم إنشاء كل صفحات الويب باستخدام PHP.
1. نقطة الانطلاق :
فتح الصفحة الرئيسية لمجموعة الموقع التصوير بالرنين المغناطيسي في الجينوم http://mco321125.meduohio.edu/ ~ jbechtel / gmri /. الموارد على شبكة الإنترنت يوفر أيضا تعليمات / توضيحات حول البرامج في "تعليمات (How-to/README)" الارتباط ، بينما يتم سرد كافة المواد المنشورة في الخوارزميات الجينية ، والتصوير بالرنين المغناطيسي مماثلة في "ارتباطات للموارد ذات الصلة" الارتباط.
2. إعداد وتحميل تسلسل الإدخال (ق).
إنشاء ملف بتنسيق مع FASTA تسلسل (ق) لبدء دورة التحليل GMRI. وينبغي أن يسبق كل تسلسل النوكليوتيدات في هذا الشكل مع خط واحد بدءا من الحرف ">" الذي يمثل معرف ، ثم على نفس الخط من قبل وصفا موجزا لهذا التسلسل. متواليات النوكليوتيدات للتحليل GMRI يسمح أيضا شخصيات مثل R ، Y ، N ، X ، الخ Hwever ، غير - A ، T ، C ، لن أحرف G سيتم تجهيزها من قبل البرنامج وسوف يتم تخطي. ويمكن استخدام تسلسل التي تم فيها العناصر المتكررة "الملثمين" (حل محله ليالي "N") كإدخال. لاحظ أن تسلسل الأحرف هي قضية حساسة.
- بدء الدورة GMRI بالنقر على زر "ابدأ أو استئناف" على الصفحة الرئيسية الجينوم التصوير بالرنين المغناطيسي. يأخذ هذا المستخدم إلى الصفحة التي يمكن تحميلها متواليات النوكليوتيدات.
- نسخ ولصق FASTA الخاص بتنسيق تسلسل أو تحميل ملف يحتوي على سلاسل من الكمبيوتر المحلي باستخدام "اختيار ملف" الزر.
- انقر على "دورة جديدة تبدأ مع هذا الملف" الزر. وينبغي أن تظهر رسالة تأكيد فوق النافذة مدخلات تفيد أنه "تم تحميلها بنجاح تسلسل الخاص" ، ويجب أيضا أن يحصل على أبجدية "GMRI المعرف" [الموقع تطلق عليها "تسمية الدورة"] لجلسة (على سبيل المثال b16yMj) ، والتي يمكن استخدامها لاسترداد ومواصلة الدورة لمدة تصل إلى أسبوعين بعد أول استخدام.
ملاحظة : من الآن فصاعدا يشار تسلسل الإدخال إلى "userfile".
3. الحصول على توزيع الترددات قليل النوكليوتيد من متواليات الإدخال (اختياري).
انقر فوق علامة التبويب "SRI محلل" (الصف العلوي) من أجل الحصول على توزيع الترددات قليل النوكليوتيد لمجموعة كاملة من سلاسل الإدخال. SRI في اختصار لتقف على المدى القصير التجانس. في هذه المرحلة ، يمكن للمستخدم تحديد أعلى طول [أليغنوكليوتيد] (من 2 حتى 9 النيوكليوتيدات ، 6 اليلة الافتراضية) التي سيتم حساب الترددات. يتم هذا التحديد من خلال النقر على الخيار المطلوب داخل "قليل وحدات الحجم الأقصى" مربع القائمة. ثم اضغط على "تحليل ملف" الزر لبدء الحساب. وهناك تمثيل الخام من المدخلات تكوين تسلسل تظهر على الفور كجدول قصيرة في منتصف هذه الصفحة على شبكة الإنترنت وتحميل ك "userfile.comp.tbl". هذا الجدول لا يمثل سوى [أليغنوكليوتيد] الأكثر والأقل وفرة ضمن تسلسل الإدخال.
يتم إنشاء الجدول تردد كامل لجميع [أليغنوكليوتيد] ممكن ملف مسمى "userfile.comp" ، والتي يمكن الحصول عليها عن طريق وصلة "تكوين تحميل الملف".
ملاحظة : SRI محلل بحساب مجموعة كاملة من كل [أليغنوكليوتيد] متداخلة.
4. توليد متواليات عشوائية مع قليل النوكليوتيد تشكيل نفسها كما في تسلسل الإدخال (اختياري).
(مطلوب استكمال الخطوة 3 من البروتوكول للقيام بهذه المهمة).
- انقر فوق علامة التبويب "SRI مولد" (الصف العلوي) لفتح صفحة جديدة على شبكة الإنترنت أن يخلق تسلسل عشوائي. اختيار عدد من عينات عشوائية لتسلسل يمكن إنشاء باستخدام مربع قائمة على هذه الصفحة على شبكة الإنترنت. سيكون لكل من هذه الملفات تحتوي على عينة عشوائية من متواليات نفس العدد والمدة وتسلسل الإدخال في "userfile". وعلاوة على ذلك ، إذا كان يحتوي على تسلسل الإدخال غير - A ، T ، C ، G أو أحرف ، وتسلسل عشوائي سيكون "N" ليالي في المواقف ذاتها تماما كما في تسلسل الإدخال.
- اختيار أطول طول [أليغنوكليوتيد] التي سيتم تقريبها الترددات في تسلسل عشوائي. ويمكن اختيار هذا عن طريق التحقق من زر الراديو للمستوى المطلوب قليل وحدات (على سبيل المثال "4 - السائدة" لمدة أربع قاعدة [أليغنوكليوتيد]) في الجدول في وسط الشاشة. ومن الجدير بالذكر هنا أن تسلسل عشوائي سيتألف من الترددات ليس فقط على المستوى التقريبي قليل وحدات مختارة ، ولكن أيضا في المقابل من مستويات ترددات أقصر قليل وحدات ، كما في تسلسل الإدخال. تقلبات صغيرة في قليل النوكليوتيدترددات المدخلات وتسلسل عشوائي ممكنة نظرا لتطبيق الإجراء النموذجي ماركوف لتوليد متواليات عشوائية.
- بدء تشغيل البرنامج بالنقر على "إنشاء ملف" الزر. إذا كان تسلسل المدخلات كبيرة قد يستغرق بضع دقائق لتوليد متواليات عشوائية. وبالتالي ، يجب أن مستخدم الانتظار حتى "تحميل" زرقاء الروابط تظهر في الجزء السفلي من هذه الصفحة. يتم وضعها في مجموعات عشوائية في الملفات التي تحمل أسماء مثل "userfile.randX_Y" حيث X هو عدد مجموعة عشوائية وY هو مستوى قليل وحدات مختارة (مثل "userfile_rand2_4").
5. تحليل متوسط التجانس (MRI) من الإدخال ومتواليات عشوائية.
- انقر على "التصوير بالرنين المغناطيسي محلل" التبويب (الصف العلوي) ، والذي يفتح صفحة الويب الجديدة التي يحلل التجانس متوسطة المدى لتكوين تسلسل النوكليوتيدات.
- تحديد تسلسل ليتم تحليلها من "ملف لتحليل" مربع القائمة (الاختيار بين تسلسل المدخلات ومجموعات توليد متواليات عشوائية يمكن جعل هنا).
- اختيار نوع المحتوى التصوير بالرنين المغناطيسي ليتم تحليلها من خلال مربع القائمة المقدمة. (الخيارات المتاحة محتوى سبعة : G + C ؛ G + A ؛ G + T ، A ؛ G ، C ، أو T.)
- اختيار طول النافذة التي سيتم فحص تسلسل غنية المحتوى والمضمون للفقراء عن طريق "حجم إطار" مربع قائمة (الافتراضي هو 50 النيوكليوتيدات ، ومجموعة غير صالحة 3-10).
- اختيار عتبة عتبة العلوية والسفلية للمناطق غنية المحتوى والمضمون للفقراء ، على التوالي. ويمكن تعريف هذه العتبات من قبل عدد من النيوكليوتيدات الدقيقة سيما في الإطار الحالي (باستخدام الخيار الرقم في مربع القائمة) أو عن طريق النسبة المئوية لهذه النيوكليوتيدات في إطار (باستخدام الخيار بواسطة نسبة مئوية)
- بعد أن أحرز كل الخيارات الخمسة (على سبيل المثال : تسلسل = "userfile" ؛ المحتوى = GC ؛ حجم الإطار = 50 ؛ العتبة العليا = 35 ؛ السفلى عتبة = 15) ، واستدعاء البرنامج عن طريق الضغط على زر تحليل ملف. البرنامج من خلال فحص جميع متواليات من مدخلات مختارة على التوالي. في كل خطوة فإنه يحصل على جزء من تسلسل الحالي بطول مساو لحجم الإطار المحدد ويحسب ما إذا كان عدد أو نسبة مئوية من النيوكليوتيدات من المحتوى التي تم اختيارها هي فوق العتبة العلوية أو تحت عتبة أدنى. إذا كان إطار لا يطابق المعايير سواء ، يتم تحديد الإطار التالي المتداخلة (تحول أحد النوويدات) لنفس التحليل. عندما يتم العثور على إطار تسلسل حيث يلتقي أحد متطلبات الحد الأدنى لتكوين أو للفقراء غنية المحتوى ، برنامج يحفظ تسلسل هذه النافذة في ملف الإخراج ويولد ارتفاعا في الناتج رسومية. بعد ذلك ، ينتقل البرنامج إلى إطار غير متداخلة ومتجاورة المقبل استئناف عملية المسح إلى أن يتم التوصل في نهاية التسلسل.
- بعد الانتهاء من البرنامج ، وتصل إلى ملف الإخراج (مع اسم "userfile_GC_50_35.. 15" للمثال أعلاه) يظهر ويتم عرض تمثيل رسومي للنتائج في منتصف صفحة الويب (انظر الشكل 1). على هذا العرض الرسومية هي متسلسلة جميع مدخلات من متواليات userfile في سلسلة واحدة وكما عرضت خط أسود على المحور الأفقي X ، مع طول في kilobases (KB) هو مبين أدناه. وتتميز جميع مناطق غنية المحتوى على طول تسلسل الإدخال كما زرقاء المسامير "الصاعد" ، ومضمون للفقراء المناطق بالحمرة المسامير "الهبوط". وتظهر الأرقام الإجمالية للنوافذ غنية المحتوى والمضمون للفقراء في parenthses في وسيلة الإيضاح في الجزء السفلي من هذا الرقم (32 و 19 على التوالي). الرقم يعمل على توضيح الوفرة النسبية وترتيب مناطق التصوير بالرنين المغناطيسي. وفي الوقت نفسه يتم تقديم تفاصيل محددة في ملف الإخراج (انظر الشكل 3). في هذا الملف ، وجميع شرائح تسلسل النوكليوتيدات التي تطابق محتوى الغنية أو الفقيرة وتنسيق المعايير الخاصة بهم متاحة للمستخدم على شكل قائمة وفقا لمواقفها على التوالي على طول ملف الإدخال.
- بعد الانتهاء من التصوير بالرنين المغناطيسي لتحليل تسلسل يمكن للمستخدم اختيار بدء عملية جديدة في نفس صفحة الويب عن طريق إجراء تغييرات على المعلمات و / أو ملفات الإدخال. على سبيل المثال ، من أجل فحص عينة عشوائية ولدت سابقا # 1 مع المعلمات في نفس التصوير بالرنين المغناطيسي ، المستخدم يحتاج فقط لتغيير ملف لتحليل وتحديد الخيار "userfile_rand1_4" الملف ، ثم اضغط على زر ملف تحليل مرة أخرى. وهناك ملف جديد وعرض رسومية يحل محل القديم. سيتم حفظ النتائج والأرقام لجميع الامتحانات في إطار كل "lable الدورة" (GMRI معرف) ، وتكون متاحة لمدة أسبوعين من النشاط الماضي. من أجل حفظ النتائج / التينures بشكل دائم ، يجب على المستخدم تحديد "تحميل الملفات" التبويب (الصف العلوي) وتحميل الدورة بأكملها أو الملفات الفردية ، حسب الحاجة.
- هذه الصفحة مع محلل شبكة الإنترنت يمكن للمستخدم التصوير بالرنين المغناطيسي الدراسة
- (G + C) والغنية (A + T) المناطق الغنية
- البيورين (A + G) الغنية بالنفط والبيريميدين (C + T) المناطق الغنية
- كيتوني (G + T) الغنية بالنفط والأمينية (A + C) المناطق الغنية
- A - A الأغنياء والفقراء والمناطق
- G - G الأغنياء والفقراء والمناطق
- T - T الأغنياء والفقراء والمناطق
- C - C الأغنياء والفقراء والمناطق
- الإصدار الأخير من التصوير بالرنين المغناطيسي والجينوم خيارا جديدا لدراسة المناطق الغنية مع البيورين (R) / البيريميدين (ص) اختلاف الأنماط التي يمكن أن تشكل Z - DNA التشكل. حاليا ، هذا الخيار هو متاح من وصلة "Z - DNA" ، وأنها تعمل على أساس نفس المناطق الأخرى المذكورة آنفا التصوير بالرنين المغناطيسي. وينبغي للمستخدم تحديد العتبات العلوية والسفلية لعدد (ريال + RY) dinucleotides متداخلة في إطار المسح. برنامج تنتج انتاج رسومية مماثلة وملف شرائح الحمض النووي المخصب والمنضب من قبل وpyrimidines البيورينات بالتناوب. يجب أن يكون المفترضة Z - DNA المناطق عالي التخصيب بحلول بالتناوب R / Y القواعد (انظر استعراض F & F 2011).
6. إضافية ضمن حزمة برامج التصوير بالرنين المغناطيسي الجينوم (اختياري).
الموارد الجينية التصوير بالرنين المغناطيسي أيضا اثنين من الخيارات المتقدمة لتوليد متواليات عشوائية محددة للغاية. فهي متوفرة من خلال "مولد التصوير بالرنين المغناطيسي" و "مولد CDS" علامات التبويب في الصف العلوي.
- التصوير بالرنين المغناطيسي مولد يخلق عشوائية متواليات مع تشكيل قليل النوكليوتيد نفس ملف الإدخال (على غرار مولد SRI). ومع ذلك ، بالإضافة إلى ذلك ، تتابع عشوائية تقليد نمط معين التصوير بالرنين المغناطيسي التي يحددها المستخدم. ضمن هذه الصفحة على شبكة الإنترنت على المستخدم ان يحدد من مربع القائمة نمط معين التصوير بالرنين المغناطيسي أن يحاكي. مربع قائمة تحتوي على كافة الأنماط التي تم بحثها في هذه الدورة من قبل محلل التصوير بالرنين المغناطيسي (على سبيل المثال "userfile_GC_50_35.. 15"). وهناك تسلسل عشوائي ولدت مع هذا الخيار لديهم نفس التكوين قليل النوكليوتيد مثل ملف الإدخال المحدد وكذلك نفس GC - الأغنياء والفقراء كما رأينا في الأنماط "userfile_GC_50_35.. 15".
- وتستخدم المولدات لCDS العشوائية للتسلسل البروتين الترميز. انه يحافظ على نفس تسلسل الأحماض الأمينية كما هو ترميز من المدخلات المحددة من قبل المستخدم. بالإضافة إلى البرنامج نفسه يحتفظ رامزة والتحيزات دى كودون كما هو محدد في الجدول المستخدم اختيار المدخلات. النسخة الإلكترونية من مولد CDS يقبل أيضا بروتين تسلسل كمدخل. وتقدم جميع الخيارات الأخرى للبرنامج إلا من خلال قائمة بذاتها مخطوطات برل متوفرة للتنزيل من صفحة الويب الجينوم التصوير بالرنين المغناطيسي الرئيسي.
7. ممثل النتائج
هذا البروتوكول يسمح للمستخدم لدراسة التجانس التركيبية من متواليات النوكليوتيدات. الأهم من ذلك ، كما أنها تدعم الجيل من مجموعة متنوعة من متواليات عشوائية مع التكوين قليل النوكليوتيد أن يقترب من تسلسل الإدخال. عادة ، وتسلسل الجيني لحقيقيات النوى المعقدة ليست متجانسة في تكوينها ، ولكنها تمثل بالأحرى فسيفساء معقدة من شرائح تسلسل النيوكليوتيدات يثريه معين (على سبيل المثال ، البيورين الغنية (G + T) الغنية ، (A + T) الغنية بالنفط ، الخ). هذه الأنماط في منتصف نطاق جدول (3-10 سنة مضت) والتي تصور الإخراج رسومية محلل التصوير بالرنين المغناطيسي الذي يظهر تحديد المحتوى الغني والتموج شرائح زرقاء العلوي ومضمون للفقراء والشرائح الدنيا التموج الحمراء (انظر الشكل 1 و 2). عادة ، وعدد من أي مناطق غنية المحتوى والمضمون للفقراء في تسلسل الطبيعي (الشكل 1) وبناء على أمر من أضعاف عدد من الأنواع نفسها من المناطق العشوائية في تسلسل المقابلة (الشكل 2) لديها نفس قليل النوكليوتيد التكوين. قد تكون هذه القطع التسلسل مع منتصف المدى التجانس في تركيبة النوكليوتيدات تكون ذات فائدة للمستخدم. فهي متوفرة من ملفات الإخراج الجينوم التصوير بالرنين المغناطيسي لاجراء مزيد من التحقيقات.
الشكل 1. مثال الإخراج محلل MRI رسومية من الخطوة 5.7. وقد تم الحصول على النتائج على عينة من 44 الإنترونات الإنسان. أشرطة زرقاء تمثل مواقف GC - الغنية هذه المناطق على طول الإنترونات. أشرطة حمراء تمثل GC - الفقراء (أو AT الغنية) التصوير بالرنين المغناطيسي المناطق. ذ محور يحتوي العتبات العلوية والسفلية لنوع محتوى معين.
الرقم 2 محلل التصوير بالرنين المغناطيسي. الإخراج للتسلسل عشوائي "userfile.rand1_4".
وgraphiكال تمثيل التصوير بالرنين المغناطيسي ضمن تسلسل عشوائيا باستخدام برنامج مولد SRI.
الشكل 3. مثال على بداية ملف إخراج النصوص من محلل التصوير بالرنين المغناطيسي.
وتعرض جميع متواليات غنية المحتوى والمضمون بين الفقراء والكشف عنها بواسطة البرنامج في العمود (الرابع) الماضي. وتظهر مواقعهم النسبية ، ويقاس في عدد من النوافذ ، في العمود الأول. الأعمدة الثانية والثالثة هي مؤشرات للمناطق غنية المحتوى والمضمون للفقراء ، على التوالي.
Discussion
المناطق ذات تركيبة غير متجانسة النوكليوتيدات في منتصف المدى المقاييس (3-10 النيوكليوتيدات) هي فائض في جينومات حقيقيات النوى معقدة ويمكن العثور عليها في أي مكان (المناطق بين الجينات ، الإنترونات ، والمناطق غير مترجمة من exons متماثلة ، والعناصر المتكررة). كثيرا ما ترتبط هذه المناطق مع الحمض النووي التشكل غير عادية. على سبيل المثال ، تسلسل purine-/pyrimidine-rich تميل إلى تشكيل triplexes الحمض النووي (DNA - H) ؛ ترتبط سلاسل بالتناوب مع البيورين / بيريميدين مع قواعد Z - DNA التشكل ؛ (G + C) المناطق الغنية يحمل تشوهات هيكلية في B - الحمض النووي ، ويمكن أن تكون عرضة للانشقاق العمود الفقري ، قد (A + T) الغنية مناطق تشكل بنية غير عادية -- وهي الحمض النووي بتفكيك عنصر ، وما إلى ذلك (التي استعرضها فيدوروف وFedorova 2010). نادرا ما يتم التحقيق في بعض هذه الأنماط المتوسطة المدى (على سبيل المثال (G + T) المناطق الغنية) لا تزال تنتظر الاستكشاف وشامل والاعتراف بها. الهدف الرئيسي لدينا الموارد الجينية الويب التصوير بالرنين المغناطيسي هو لمساعدة المستخدمين في تحديد هذه المناطق التصوير بالرنين المغناطيسي لتحليلهم التجريبية وكذلك لاستكشاف وظائفهم ممكن. ويمكن إدراج المعرفة في مناطق التصوير بالرنين المغناطيسي وتحسن الجيل الجديد من برامج توقع الجين (شيبرد 2010) وتعميق فهمنا للوظائف وخصائص الجينوم.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لشيبرد صموئيل ، Bazeley بيتر وجون ديفيد بيل لإدارة صفحات الويب الجينوم التصوير بالرنين المغناطيسي. وأيد هذا العمل من قبل شهادة من مؤسسة العلوم الوطنية "التحقيق في أدوار الخلوية إنترون" جائزة [عدد المنح MCB - 0643542].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer with Internet | |||
| Files with nucleotide sequences for examination |
References
- Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures. BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).
- Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales. BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).
- Fedorov, A., Fedorova, L. Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale. Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery. , 65-91 (2010).
- Shepard, S. S. Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio. The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]. , The University of Toledo. 57-157 (2010).
