Summary
neuromuscular जंक्शन (NMJ)
Protocol
1. Immunofluorescence के लिए तैयार:
- विदारक सतह बनाने के लिए, एक छोटे से टिशू कल्चर थाली में Sylgard 184 सिलिकॉन Elastomer बेस डालना. नहीं थाली पूरी तरह से इतना है कि विच्छेदन क्षेत्र रिम से कम है भरने के लिए सुनिश्चित करें.
- हेरफेर की वृद्धि आसानी के लिए लगभग 3.5mm लंबाई को विच्छेदन पिन छाँटो, और लार्वा प्रति कम से कम 6 पिंस है सुनिश्चित करें.
- आप कुंद संदंश है कि आप विच्छेदन के लिए पिन समझ की अनुमति देगा की आवश्यकता होगी.
2. लार्वा के विच्छेदन:
- तीसरे instar लार्वा कि शीशी के पक्ष चारों ओर रेंग रहे हैं और शुरू कोषस्थ कीट धारण करना नहीं भटक चयन करें.
- Stereomicroscope तहत विच्छेदन की सतह पर एक लार्वा रखें. दूर अतिरिक्त एक Kimwipe का उपयोग moister बाती.
- प्रत्येक लार्वा ताकि पृष्ठीय पक्ष का सामना करना पड़ रहा है व्यवस्थित. तुम लार्वा के पृष्ठीय पक्ष के साथ दो ट्रेकिआ, सफेद लाइनें देखने में सक्षम हो जाएगा. बीच में इन केंद्र जितना संभव करने की कोशिश करो क्योंकि इस पृष्ठीय midline निशान.
- बस मुँह हुक ऊपर प्लेस # 1 पिन (चित्रा 1).
- पिन tracheae बीच spiracles बस के ऊपर पूंछ में # 2 प्लेस.
- छल्ली के सूखने को रोकने के लार्वा को पीबीएस की एक छोटी राशि जोड़ें.
- सभी लार्वा के साथ उपरोक्त चरणों को दोहराएँ, यकीन है कि जीनोटाइप spatially प्रत्येक जीनोटाइप के बीच एक पिन रखकर अलग हो रहे हैं.
- दोनों tracheas (चित्रा 1) के पार पिन # 2 के ऊपर एक छोटे अनुप्रस्थ काट सही बनाओ.
- Tracheas के बीच पृष्ठीय midline साथ पहली कट कट और सभी तरह अतीत पिन अप # 1 में अपनी कैंची डालें.
- आप छल्ली के प्रत्येक पक्ष के बहुत ऊपर और नीचे में अन्य छोटे कटौती करने की जरूरत है, ताकि बाएँ और दाएँ पक्ष को खोलने के लिए आप उन्हें पिन नीचे छल्ली पर खींच के बिना अनुमति देगा.
- प्लेस पिन # 3 ', 4, 5, और 6 प्रत्येक कोने पर.
- 4% पीएफए के साथ कमरे के तापमान पर 20-25 मिनट के लिए नमूना फिक्स
- पीएफए छानना और पीबीएस 3-4 बार कुल्ला, हर बार decanting.
3. ऊतक के हटाने:
- पीछे अंत में ऊतकों को हटाने, क्योंकि आम तौर पर आप ऐसा क्षेत्र है जहां मस्तिष्क स्थित है की रक्षा करना चाहते हैं के द्वारा शुरू करो.
- जबकि एक steromicroscope का उपयोग कर और पीबीएस की एक बूंद के तहत लार्वा के साथ, पहले ट्रेकिआ के पीछे अंत हड़पने के लिए और इसे बाहर खींच जो के साथ यह वसा शरीर के कुछ निकाल सकते हैं. दूसरा ट्रेकिआ के लिए दोहराएँ.
- पीछे वसा शरीर या आंत के कुछ ले लो और उन्हें प्रस्तुत करने के बाहर निकलने. एक बार पीछे ऊतक के सबसे हटा दिया गया है, मस्तिष्क के आसपास छोटे ऊतकों को हटाने पर ध्यान केंद्रित. यदि आप केवल मांसपेशियों, या NMJ की आकारिकी में रुचि रखते हैं आप मस्तिष्क के रूप में अच्छी तरह से निकाल सकते हैं.
- मस्तिष्क का हटाया 31 स्नायु, जो पेट खंड उन्मुखीकरण के लिए एक उपयोगी मार्कर के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता है.
4. सक्रिय जोन के लिए immunofluorescence:
- विच्छेदन डिश में dissected preps अवरुद्ध एजेंट (5% पीबीएस में सामान्य बकरी सीरम) जोड़ें. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ब्लॉक. यदि आप केवल अवरुद्ध और एंटीबॉडी dilutions के लिए एक समाधान बनाने के लिए करना चाहते हैं, 0.1% अपने ऊतक permeabilization के लिए अवरुद्ध एजेंट के लिए TritonX-100 शामिल हैं.
- प्राथमिक 0.1% TritonX 100 के साथ अभिकर्मक अवरुद्ध में पतला एंटीबॉडी लागू करें. सक्रिय क्षेत्र एंटीबॉडी विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/) के माध्यम से प्राप्य है. एक संदर्भ एंटीबॉडी का प्रयोग करें (जैसे सहिजन संयुग्म peroxidase - Cy3) NMJ झिल्ली और axons लेबल.
- 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी सेते हैं. ताकि रेफ्रिजरेटर का सूखापन एंटीबॉडी समाधान नहीं लुप्त हो जाना जाएगा, एक प्रयोग किया विंदुक टिप बॉक्स के नीचे में थोड़ा पानी डाल द्वारा एक आर्द्रता चैम्बर बनाने. कवर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पारदर्शी ढक्कन फ्लोरोसेंट कम विरंजन. आर्द्रता चैम्बर में विच्छेदन स्लाइड प्लेस और 4 ° सी इनक्यूबेटर में रातोंरात पूरे बॉक्स डाल दिया.
- अगली सुबह, PBST (0.2% ट्राइटन-X-100 के साथ पीबीएस) 5-10 मिनट के लिए 5-10 बार के साथ धो लो.
- माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे Invitrogen Alexa बकरी विरोधी माउस 488) 0.1% TritonX 100 के साथ कवर आर्द्रता चैम्बर में 2-4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अभिकर्मक रोकने में पतला के साथ सेते हैं. माध्यमिक में एक परमाणु दाग (जैसे DAPI) शामिल है, अगर आप मांसपेशियों या मस्तिष्क में नाभिक के स्थान की पहचान करना चाहते हैं.
- 5-10 मिनट के लिए PBST (0.02% Triton एक्स-100 के साथ पीबीएस) के साथ 5-10 बार धोएं.
5. स्लाइड पर लारवल नमूने बढ़ते:
- छानना और बंद पिछले PBST धोने बाती.
- पिपेट लगभग 1ml 80% ग्लिसरॉल के लिए नीचे टिकी लार्वा pelts कवर.
- सभी लार्वा में 6 पिन के 5 निकालें.
- जब आप किसी स्लाइड पर पहली जीनोटाइप डाल कि genoty के सभी लार्वा के लिए पिछले पिन निकालने के लिए तैयार हैंपे.
- अपने बढ़ते माध्यम से एक साफ स्लाइड पर दो बूँदें डाल द्वारा एक "धोने" स्लाइड तैयार. यह कदम महत्वपूर्ण है लार्वा बंद बढ़ते और साफ इमेजिंग के लिए पानी के समाधान धो.
- एक लार्वा अपने कुंद संदंश के साथ पूंछ से ले लो, चारों ओर ग्लिसरॉल में लार्वा खींचें और फिर अपने विच्छेदन पकवान की सूखी किनारों के साथ, ग्लिसरॉल के बहुमत को दूर. पहली बढ़ते मध्यम ड्रॉप में लार्वा प्लेस.
- इसी जीनोटाइप के लार्वा के सभी के लिए चरण 6 दोहराएँ.
- एक बार सभी लार्वा पहली बढ़ते मध्यम ड्रॉप में, पूंछ से पहले लार्वा ले लो और यह ड्रॉप और पकवान की सूखी किनारों के साथ तो मध्यम के बहुमत को निकालने के माध्यम से खींच. फिर दूसरा बढ़ते मध्यम ड्रॉप में लार्वा जगह है.
- इसी जीनोटाइप के साथ सभी लार्वा के लिए 8 कदम दोहराएँ.
- यह लेबलिंग और स्लाइड पर एक छोटे से बढ़ते मध्यम "टी" आकार रखने के द्वारा अपने अंतिम स्लाइड तैयार.
- 5.8 कदम के रूप में, पूंछ से लार्वा को आकर्षित, दूसरा बढ़ते मध्यम और "धो स्लाइड के सूखी पक्षों के साथ तो ड्रॉप के माध्यम से खाल खींच. मध्यम के बहुमत के बाद से आ गया है, बढ़ते मध्यम में अंतिम स्लाइड पर लार्वा खाल जगह है.
- सभी लार्वा pelts के लिए दोहराएँ.
- सुनिश्चित करें कि सभी लार्वा pelts वांछित के रूप में यकीन है कि छल्ली नीचे की ओर है और उजागर मांसपेशियों का सामना करना पड़ रहा है बनाने की व्यवस्था कर रहे हैं.
- स्लाइड पर एक आवरण पर्ची dissected लार्वा को कवर "टी." के ऊपरी पंक्ति में शुरुआती बढ़त के साथ प्लेस,
- कवर पर्ची पर एक छोटे से वजन (जैसे 9 वोल्ट की बैटरी) रखो, यकीन है कि बढ़ते मध्यम कवर पर्ची के तहत पूरी तरह से फैलता है.
- संभव फ्लोरोसेंट शमन कम करने के लिए, एक दराज या गहरे अंतरिक्ष में स्लाइड जगह जब तक बढ़ते मध्यम ठीक है.
- साफ बढ़ते मध्यम है कि कवर पर्ची की धार overflowed. कवर या 70% इथेनॉल के साथ पर्ची स्लाइड पर अतिरिक्त सूखी बढ़ते मध्यम साफ करें.
- अंतिम मुहर बनाने के लिए, नाखून पॉलिश के साथ सील.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
Dissected और immunostained लार्वा का एक उदाहरण है स्लाइड चित्रा 2 में दिखाया गया है. जब लार्वा dissections, दाग, बढ़ते और ठीक से कर रहे हैं, तो उपयोगकर्ता A2-A6 क्षेत्रों में ब्याज के लार्वा मांसपेशियों (चित्रा 3) की पहचान कर सकते हैं. होआंग एट अल. मांसपेशियों की स्थिति का एक विस्तृत वर्णन के रूप में अच्छी तरह के रूप में विशिष्ट synaptic BOUTONS (होआंग और चिबा, 2001) के लक्षण वर्णन प्रदान करता है . उपयोगकर्ता एक उच्च शक्ति उद्देश्य का उपयोग एक एकल synapse पर ध्यान केंद्रित करने और z-ढेर छवि ले जा सकते हैं. 6 / 7 synapse के एक हिस्से के एक प्रतिनिधि अधिकतम प्रक्षेपण छवि दिखाया गया है (चित्रा 4). फिर इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग, सक्रिय क्षेत्रों मात्रात्मक विशेषताओं है कि विशेष रूप से अपने उत्परिवर्ती phenotype कर रहे हैं के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है. सुविधाओं है कि एक विशेष उत्परिवर्ती phenotype में बदला जा सकता है है के उदाहरण कुल संख्या, flourescence तीव्रता, और सक्रिय क्षेत्रों के बीच रिक्ति शामिल हैं.
संभावित नुकसान:
लार्वा neuromuscular जंक्शन के immunofluorescence मूल्यांकन एक मूल्यवान प्रणाली है कि synaptic जीव विज्ञान में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, हालांकि वहाँ संभावित नुकसान है कि इस प्रणाली की उपयोगिता सीमित कर सकते हैं कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, अक्सर यह छवि के लिए वांछनीय है दो या दो से अधिक प्राथमिक एंटीबॉडी के ही नमूने में धुंधला पैटर्न है. उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी, उचित fluorophores, और उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण के विकल्प सफलता के लिए आवश्यक है.
यदि इमेजिंग अपने प्रयोग में दो प्रतिजनों, निश्चित है कि प्राथमिक एंटीबॉडी ताकि ब्याज की प्रत्येक प्रोटीन विशिष्ट fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पहचाना जा सकता है है विभिन्न प्रजातियों में से एक हैं. एक सिफारिश की पृष्ठभूमि को कम करने के लिए एक अवरुद्ध एजेंट का उपयोग करें जिसमें से माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में सामान्य बकरी सीरम का उपयोग करें जब बकरी खरगोश विरोधी या विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर) प्राप्त किए गए प्रजातियों के सामान्य सीरम युक्त है.
प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी है कि आप अपने प्रयोग में प्रयोग करेंगे की योजना बना करने के बाद, आप भी अपने धुंधला में नियंत्रण सहित पर विचार करना चाहिए सेट करने के लिए सुनिश्चित करें कि आप देख रहे हैं फ्लोरोसेंट संकेत है कि असली है और न सिर्फ पृष्ठभूमि है. यदि संभव हो तो, नकारात्मक नियंत्रण के नमूने है कि ब्याज की प्रोटीन शामिल नहीं है शामिल हैं. यह आसानी से एक प्रकार जंगली जानवर शामिल करके exogenous transgene overexpression के अध्ययन में किया है, लेकिन कुछ मामलों में अपने हित के प्रोटीन के एक homozygous उत्परिवर्ती का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है. एक अन्य आवश्यक नकारात्मक नियंत्रण, अपने फ्लोरोसेंट संकेत की पृष्ठभूमि के स्तर को मापने के लिए उपयोगी, प्राथमिक सहित बिना माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए है. जब इमेजिंग अपने परिणामस्वरूप preps, यह महत्वपूर्ण है को समझने के लिए कि फ्लोरोसेंट संकेत के सभी कि आप देख रहे हैं असली नहीं हो सकता है, और यो से पृष्ठभूमि हो सकता हैउर माध्यमिक एंटीबॉडी या अंतर्जात ऊतक पृष्ठभूमि से. आप अपनी छवियों को सामान्य पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति विचार जब प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच परिवर्तन के लिए परख करने की क्रिया की आवश्यकता हो सकती है.
की fluorophore विकल्प भी देखभाल के साथ किया जाना चाहिए. उत्तेजना और प्रत्येक fluorophore और विशिष्ट प्रत्येक संकेत का पता लगाने की क्षमता के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के विचार के माध्यम से चैनल खून से बचने के लिए आवश्यक है. अगर वहाँ किसी भी अनिश्चितता लिए तय है कि खून के माध्यम हद तक एक समय में एक एकल fluorophore लेबल एंटीबॉडी के साथ immunostain और प्रत्येक चैनल के साथ छवि की जांच करने के लिए कि आप अपने अंतिम प्रयोग में उपयोग किया जाएगा एक सरल तरीका है. यह अगर के माध्यम से खून अपने खुर्दबीन फ़िल्टर सेट के साथ होने वाली है प्रकट करना चाहिए.
चित्रा 1 छल्ली काटने और 1-6 पिन. के स्थान फ्लो चार्ट एक बड़ी छवि को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें
चित्रा 2 अंतिम स्लाइड पर लार्वा की नियुक्ति. सुनिश्चित करें कि लार्वा preps मांसपेशियों पक्ष उजागर कर रहे हैं ऊपर और नीचे छल्ली पक्ष. प्रत्येक नमूने के बीच कम से कम एक लार्वा शरीर चौड़ाई छोड़ो.
चित्रा 3. जब इमेजिंग, ब्याज की मांसपेशियों और क्षेत्रों का पता लगाने. आम neuromuscular जंक्शनों अंदर आना 6 / 7, मांसपेशियों मांसपेशी 13, 12 मांसपेशियों, या 4 मांसपेशी होती है. उदर midline के विपरीत पक्ष पर, वहाँ दिखाया Hemi - खंड की एक दर्पण छवि मांसपेशियों संरचना है. खंड जो आप इमेजिंग कर रहे हैं की पहचान के लिए एक मार्कर के रूप में 31 स्नायु का प्रयोग करें. एक ही छवि synapses और अपने नमूने के बाकी के लिए खंडों, कि मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जीनोटाइप के प्रति कई synaptic छवियों का संग्रह.
चित्रा 4. NMJ innervating मांसपेशियों 6 / 7 के एक हिस्से के एक प्रतिनिधि अधिकतम प्रक्षेपण छवि दिखाया गया है. NC82 धुंधला (Bruchpilot) हरे रंग में दिखाया गया है. पूर्व synaptic एचआरपी दाग लाल रंग में दिखाया गया है. नोट सक्रिय क्षेत्र punctae कि आगे इमेजिंग सॉफ्टवेयर के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है.
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Discussion
न्यूरॉन्स के लिए, synaptic टर्मिनल क्षेत्र के महत्व का है, और के बाद और पूर्व synaptic कोशिकाओं के बीच समुचित संचार के लिए पुल है. रोग मॉडल में न्यूरॉन के स्वास्थ्य की जांच के लिए एक शक्तिशाली तरीका immunofluorescence द्वारा synaptic टर्मिनल के प्रोटीन का विश्लेषण है. immunofluorescence विधि यहाँ प्रस्तुत शोधकर्ता कई लार्वा की जांच करने के लिए एक साथ जबकि समूहों के बीच पर्यावरण मतभेद सीमित करने के लिए सक्षम बनाता है. ड्रोसोफिला तीसरे instar लार्वा के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र glutamatergic synapses, मैप और दोहराया synaptic टर्मिनलों, पहुंच, reproducibility और आनुवंशिक हेरफेर की शक्ति सहित कई फायदे हैं. ड्रोसोफिला neuronal रोग मॉडल में विशेष रूप से सक्रिय क्षेत्र प्रोटीन Bruchpilot के स्तर को बदल दिया गया है . क्योंकि लार्वा की बड़ी संख्या में एक साथ assayed, सक्रिय क्षेत्र विश्लेषण प्रस्तुत विधि का उपयोग कर अनुसंधानकर्ता के समूहों के बीच सूक्ष्म मतभेद है कि न्यूरॉन के स्वास्थ्य में एक मौलिक दोष को प्रतिबिंबित कर सकता का पता लगाने में सक्षम बनाता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम इस पांडुलिपि के बारे में अपनी सहायक टिप्पणियों के लिए डा. Nael Alami और डॉ. वियतनाम चुल किम धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science Tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson ImmunoResearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
References
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