نحن يبرهن على وجود مناعي لونين (CHIP) طريقة لتحديد التفاعلات عامل في جينات محددة الأنسجة أثناء أو بعد ظهور الأنسجة محددة التعبير الجيني في الأنسجة الجنينية الماوس. هذا ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع بروتوكول لدراسة تفعيل الجين الأنسجة محددة كما يحدث أثناء التطور الجنيني الطبيعي.
الكروماتين مناعي (رقاقة) هو أداة قوية لتحديد البروتين : التفاعلات التي تحدث لونين في سياق الخلايا الحية 1-3. وقد تم استغلال هذه التقنية على نطاق واسع في خلايا الأنسجة ، وإلى حد أقل ، في النسيج الأساسي. معقد تطبيق الشذرة في الأنسجة الجنينية القوارض ، وخصوصا في أوقات مبكرة من التنمية ، من كمية محدودة من الأنسجة والخلايا وعدم تجانس أنواع الأنسجة في الجنين. هنا نقدم وسيلة لتنفيذ الشذرة به يوميا نأت الجنينية 8.5 (E8.5) الجنين. ويمكن تقسيم المنفصمة لونين من جنين واحد إلى E8.5 تصل إلى خمس aliquots ، والذي يسمح للمحقق مادة كافية لعناصر والتحقيق للبروتين معين : التفاعلات لونين.
وقد استخدمت هذه التقنية لأننا نبدأ في الوثيقة البروتين : التفاعلات ونين خلال مواصفات الأنسجة برامج محددة التعبير الجيني. عدم تجانس أنواع الخلايا في الجنين يقيد بالضرورة تطبيق هذا الأسلوب لأن النتيجة هي الكشف عن البروتين : التفاعلات ونين دون تمييز ما إذا كانت التفاعلات تحدث في كل شيء ، مجموعة فرعية من ، أو نوع خلية واحدة (ق). ومع ذلك ، وفحص الأنسجة محددة الجينات أثناء أو في أعقاب ظهور الأنسجة محددة التعبير الجيني هو ممكن لسببين. أولا ، مناعي من العوامل المحددة الأنسجة المعزولة بالضرورة لونين من نوع الخلية حيث يتم التعبير عن عامل. الثانية ، لا ينبغي للمناعي coactivators histones والتي تحتوي على بعد متعدية التعديلات التي ترتبط مع تنشيط الجينات يمكن العثور على الجينات وتسلسل الجينات التنظيمية في نوع من الخلايا الجينات حيث يجري أو قد تم تفعيلها. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق تقنية لدراسة معظم أنسجة محددة الأحداث التنشيط الجيني.
نحن المستخدمة في المثال المبين أدناه ، وE8.5 E9.5 أجنة الفئران لدراسة عامل ملزم في جين معين المروج العضلات والهيكل العظمي. Somites ، وهي الأنسجة التي السلائف من عضلات الهيكل العظمي من الجذع والأطراف وشكل ، وموجودة في E8.5 9.5 – 4،5. Myogenin عامل التنظيمية اللازمة لتمايز الهيكل العظمي والعضلات 6-9. بيانات تثبت أن يترافق مع المروج myogenin الخاصة في E8.5 E9.5 والأجنة. لأن يعبر فقط myogenin في somites في هذه المرحلة من التنمية 6،10 ، وتشير البيانات إلى أن التفاعلات مع المروج myogenin الخاصة بها قد حدثت بالفعل في الهيكل العظمي خلايا العضلات في السلائف E8.5 الأجنة.
الشذرة في البروتوكول وصفها ، نظهر أن يرتبط myogenin منظم عضلي مع المروج myogenin في الأنسجة العضلية الهيكلية موجودة في E8.5 السلائف واحد والأجنة E9.5. لقد تميزت الدراسات السابقة على نطاق واسع myogenin ملزمة لمربع البريد التي تحتوي على متواليات ، بدءا من التجارب الأولية في المختبر…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 GM56244 لاعلام ، والذي يتضمن منح الأموال من خلال الأميركي لإنعاش الاقتصاد وإعادة الاستثمار قانون عام 2009 ، والمعاهد الوطنية للصحة في R01 GM87130 JARP
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |