Summary
ampliPHOX比色法检测技术是作为一种廉价的替代芯片荧光检测。 ampliPHOX聚合的基础上，产生的固体聚合物点，在短短几分钟内肉眼可见。结果将被自动成像和解释一个简单但功能强大的软件包。
Abstract
DNA芯片已成为一个病原体检测的有力工具。1-5例如，已被证明的能力类型和亚型流感病毒的例子很多。6-11识别和亚型流感DNA芯片应用在公共健康和诊所，以便及早发现，迅速介入，并最大限度地减少流感大流行的影响。传统的荧光是目前最常用的基因芯片检测方法。然而，由于基因芯片技术对临床使用过程，取代昂贵的仪器，成本低的检测技术表现出相似的性能特点，荧光将使芯片检测更具吸引力和成本效益。
ampliPHOX比色法检测技术是用于研究中的应用，和传统荧光11的幅度内之一为了一个近似的10倍仪器成本较低的优势，比焦荧光微阵列芯片扫描仪需要与主要的检测限，检测。另一个优点是体积小巧，仪器的可移植性和灵活性允许不同于传统的荧光仪器。因为聚合技术是不是天生荧光检测线性的，但是，它是最好的适合密度较低的芯片应用中存在一定的顺序是/没有答案所需，如病原体检测阵列。目前最大的现货密度与ampliPHOX检测兼容〜1800点/阵列。由于现场密度的限制，高密度微阵列不适合ampliPHOX检测。
在这里，我们目前作为一个信号放大方法对流感病毒的检测和表征（流感集成电路芯片）开发的低密度芯片ampliPHOX比色法检测技术。虽然这个协议使用一个特定的应用程序，任何芯片，结合生物素化的目标，可以标记，并以类似的方式检测ampliPHOX检测流感集成电路芯片（DNA芯片）。被捕获的芯片设计和生物素化的目标是用户的责任。一旦阵列上已捕获生物素化的目标，ampliPHOX检测可以进行与链霉亲和标签的共轭（ampliTAG）的数组，第一个标记。 （ampliPHY）使用ampliPHOX读者仪器，聚合单体溶液的光曝光后只发生在含有ampliTAG标记的目标地区。聚合物形成一种无毒的解决方案，以改善视觉对比度，成像和使用的一个简单的软件程序包（ampliVIEW）分析，随后可沾上。从整个联合国提取样本流感集成电路芯片检测结果可在约6个小时，和上面所述的ampliPHOX检测步骤，可以在大约30分钟完成。
Protocol
1。用RT - PCR样品扩增
- 提取病毒RNA的临床物质或病毒隔离QIAcube全自动核酸提取平台一起使用Qiagen公司MinElute病毒自旋套件。拔牙是200μL标本与最终洗脱体积60μL。商店提取物在-70 ° C或较低，以供日后使用。
- 在模板中自由区，准备上冰的RT - PCR扩增预混，根据制造商的协议。在RT - PCR技术结合生物素，使用制造商提供的dNTP混合液进行生物素化的dNTP混合物。使用生物素化的dNTP混合物的成本低于1美元/检测。也可用于替代方法，如使用生物素标记的引物生物素掺入。甲型流感混合添加引物的最终浓度为1.0μM，1.0微米流感乙，和内部控制的0.14微米。甲型流感引物放大矩阵基因片段（1032 NT产品），流感乙引物扩增非结构性的基因片段（811 NT产品）。每个流感集成电路芯片引物包含一个5'磷酸基团，以方便通过的lambda以下PCR扩增的核酸外切酶消化产生的单链DNA的引物。由此产生的单链的产品需要更短的双链等效杂交倍，并大大缩短了整体检测时间。一个预先准备好这些引物的混合物以及内部控制模板RNA可从InDevR感兴趣的研究人员在有限的基础。
- 简要涡和分发18μL成薄壁PCR管的主结构。
- 转让冰管到一个合适的工作区模板此外，并添加到每个反应管中加入2μl模板。
- PCR管转移到热循环，并运行以下的温度曲线：逆转录50 ° 30分钟，激活酶失活/ 95 C ° 15分钟，30秒40 PCR周期为95 ° C，55 C ° C为30岁和72 ° C为1分，并在最后72℃延伸10分钟。
2。低密度基因芯片杂交RT - PCR产物
- 为了生成单一的双链DNA流感集成电路芯片杂交，1.0μL的lambda核酸外切酶，所附的反应缓冲液2.2μL，0.8μL无核酸酶水相结合的酶消化混合物准备。这些款项是一个单一的样本，但可以简单地被消化的样本总数的比例。删除从热循环仪的样本和4μL准备好的混合物添加到每个反应消化的PCR产物的磷酸化链。返回到摄氏15分钟，95摄氏度10分钟才能完成酶解法和热碎片步骤度至37度的热循环仪的热循环和程序的样本。
- 自定义使用的流感芯片上印有醛官能玻片应用微阵列技术公司（坦佩，AZ）。 5' -氨基终止捕获序列相结合，与优化斑点缓冲区，并在终浓度为20微米印刷（除另外有一个3' -生物素的修改，并发现了500 Nm的终浓度为阳性对照序列） 。使用非接触斑点的方法是，用最佳的光斑直径300微米，中心，中心间距700微米。
- 从存储中删除微阵列和删除的保护板和紧迫以及周边各地坚决周围的芯片适用于一次性使用的杂交井。
- 含有110毫升的纯净水5分钟在60-90 RPM使用预杂交的轨道振动筛洗一洗斌地点的幻灯片。轻轻触摸组织雨刮器以及边缘，使水恶人远离干燥的阵列。
- 结合每个零散的单链DNA产品22μL2X杂交缓冲液，吸管40μL杂交到芯片井的解决方案。
- 允许的幻灯片在封闭的湿度室为60分钟杂交。
- 从湿度试验箱中取出的幻灯片，简单地在冲洗瓶冲洗洗缓冲液D阵列前放置到幻灯片机架。通常的洗涤缓冲液D的冲洗量是2毫升每阵列。广场滑动机架包含幻灯片洗斌含110毫升清洗缓冲液A的轨道摇床在60-90 1分钟的转速下的bin。
- 从洗涤缓冲液中取出一个滑动机架，简单冲洗洗缓冲液D，转移滑动机架的bin包含洗缓冲液B，在60-90 5分钟的转速和动摇。
- 轻轻擦干每张幻灯片上的阵列，并放置在恒温恒湿ampliPHOX色度检测步骤准备干的幻灯片。
3。 ampliPHOX：标签与ampliTAG杂交的产品和校准芯片
- 结合 ampliTAG 10μL，20μL2X ampliTAG缓冲区，10μL纯化水为每个要处理的数组。试剂卷可以简单地为样本总数的比例。请一定要准备足够的标签混合物帐户所需的所有样品阵列和校准阵列。校准需要的芯片数量取决于您是否正在执行一个完整的校准（一个新的文书或新批号的试剂），或只是一个仪器检查。对于一个完整的校准，应标有3个校准芯片和一种试剂的检查，只是一个单一的校准芯片应标。请注意，校准阵列标记之前，他们应该去通过预杂交洗涤步骤以前流感阵列。
- 40μL的标签混合传输到每个阵列，并允许标记反应进行5分钟的一个封闭的恒温恒湿。
- 立即用洗涤缓冲液D阵列前放置幻灯片在幻灯片机架的冲洗瓶。转移到含有110毫升的洗涤缓冲液C的bin的机架，并在60-90 RPM震动5分钟。
- 使用第二个洗斌充满了纯净水，连续执行三个简短的水逢低删除盐渣。干井的边缘轻轻触摸组织雨刷阵列。
- 该芯片现在适当的标签，ampliTAG ampliPHOX检测程序的其余部分可以执行。 Photoactivation和标记阵列成像应在24小时内完成，和额外的阵列，可以存储在一个黑暗的幻灯片中，直到使用。
4。 ampliPHOX：校准，信号放大和成像
- 打开ampliPHOX读者和确保ampliVIEW软件photoactivation准备。
- 确定的最佳photoactivation时间，使用校准芯片。另外的简要介绍如下，还简要介绍了此过程中详细的ampliPHOX操作手册。校准芯片包含一系列的生物素标记的控制序列，利用优化校准芯片产生一个积极的信号，由软件确定的行数最大化的目标检测的灵敏度，稀释。
- 删除ampliPHY从4 °，让温暖的室温，涡旋简单组合。吸取3μLampliPHY增强剂ampliPHY小瓶，10秒和涡彻底。
- 均匀地转移到40μLampliPHY解决方案以及含有ampliTAG标记阵列芯片，确保无气泡存在。关闭每一个应用程序之间ampliPHY的小瓶。插入ampliPHOX读者photoactivation湾的芯片的幻灯片。
- 对于第一次校准阵列，使用默认photoactivation时间在软件的左侧面板上的“时代”框，然后按一下绿色的“开始”按钮启动的photoactivation。一旦完成，删除阵列，并用纯净水，去除多余的ampliPHY冲洗。现在应该可以看到透明的聚合体形成的斑点。
- 允许聚合物点干2分钟，然后分发两滴ampliRED的阵列上，并允许染色进行2分钟。
- 接下来，快速冲洗芯片与纯净水，用纸巾擦拭干。
- 插入成像湾ampliPHOX读者的芯片，在成像“选项卡，然后单击”捕捉新形象“按钮。一旦影像，调整作物和保存图像。
- 在分析“选项卡，选择校准掩膜和”自动放置“按钮开始分析。该软件会自动产生一个“摘要记录”显示的量化结果。基于这些结果，photoactivation时间由10秒调整为第二校准阵列，并重复这个过程。
- 后的最佳photoactivation时间已经确定，可以使用相同的信号放大和成像协议，用于校准阵列处理的样品阵列。
- 一旦图像捕获样本阵列，为您特定的阵列布局，如这里所描述的流感阵列布局的面膜可以created.The ampliVIEW软件能够执行自动图像分析和产生的流感亚型对每一个样品的结果。
5。代表性的成果：
图1。ampliPHOX比色法检测方法的示意图。 （一）生物素标记的靶DNA杂交当场数组中的每个，及（B）与ampliTAG标记。 （三）ampliPHY解决方案，然后补充说，（四）暴露在光线下形成可见的聚合物点。 （五）形成的聚合物点，其后沾上一种无毒的染料，以提高对比度。
图2：（一）流感低密度芯片布局。序列1-7和10-13 A和序列，8，9目标乙型流感（二）ampliPHOX（三）2009年新型H1N1流感（“猪流感”），显示了相同的检测模式标本的荧光图像双方的目标流感方法。
图3：从左至右的权利，代表ampliPHOX为A型流感H3N2病毒，人类的起源H1N1，2009年新型H1N1（猪原籍），并负标本的图像。所有3种亚型显示阵列上的视觉不同的模式。注意，只有MS2的内部控制被认为是负，表明RT - PCR扩增没有受到抑制。
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Discussion
这里介绍ampliPHOX比色法检测技术是一种快速，廉价的替代单一的颜色，密度更低的芯片应用荧光检测。示意图如图1所示，检测原理的基础上使用了光引发剂的标签（1B） 。含有一种单体溶液（1C）的存在，光线照射引起的光引发剂（ampliTAG），只有在标示的地区引发的聚合反应（1D）。虽然表现为流感的识别和亚型的DNA阵列，该技术可以扩展到检测到任何一个芯片上捕获生物素化的产品。作为一个例子，我们在使用不同的试剂化学聚合检测早期的工作表明，核酸和抗体为基础的阵列，12人也显示为一个聚合为基础的系统的抗体和蛋白质为基础的应用的概念证明。在这种情况下，需要清除的惰性气体，利用不同的试剂化学品 。13,14
流感低密度基因芯片和有代表性的图像的原理可以看出， 在图 2 。如图2a所示，该数组包含一个空间标记/斑点控制（红色）和14个独特的捕获序列（蓝色），发现一式三份。捕获序列氨基酸终止合成短（〜25 MER）的寡核苷酸，捕捉流感目标基因的特定类型或亚型的流感的代表。捕获的序列设计上针对不同的A型流感亚型芯片生产明显不同的模式。图2B和2C显示了2009年新型H1N1病毒标本ampliPHOX和传统荧光，分别检测的直接比较。产生荧光的结果是使用共焦荧光微阵列扫描仪（Genetix aQuire）。相同的整体检测模式，可以很容易地看到这两种方法，但是，ampliPHOX结果是肉眼可见。
在图3所示是三个有代表性的A型流感阳性标本和一负的标本，这里描述的协议处理的ampliPHOX结果。图3A，3B，3C为人类的起源H3N2病毒，人类起源的H1N1病毒，和猪的起源H1N1（2009年新型H1N1），显示结果。在整体检测模式的一个显着区别，可以很容易地看到这3张图片。例如，它可以看出，序列2和3显示了一个亚型流感（3A - 3C）产生的信号，但序列10，12和13只生产猪的起源信号H1N1病毒标本（3C） 。以前使用的这种方法已成功地类型和亚型流感病毒的一个芯片上。6,8,10重要的是，图3d所示的负面标本显示了对内部控制的序列的信号，表明RT - PCR反应没有抑制或失败。
这些图像的解释是容易实现自动化的ampliVIEW软件。用户第一次使用软件定义的芯片布局，然后来形容它的目标应该是目前这种布局产生一定的“答案”。例如，如图2A所示流感布局可能会产生如“流感积极”，“流感乙积极的”，“非季节性流感A”，“季节性流感A”和“负”的逻辑结果，这取决于预期的成果。一旦这些逻辑分配和保存，该软件可以自动解释的图像提供了很少的用户输入的结果。
ampliPHOX检测技术的产生，密度较低，在几分钟内类似的灵敏度荧光芯片的视觉比色法结果。我们相信，组合容易使用的，与一个低成本的文书廉价试剂提供了一个有吸引力的替代传统的基因芯片检测方法，特别是作为更具有针对性，较低的密度的基因组/诊断芯片，成为越来越多地用于各种应用。
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Disclosures
所有的作者是InDevR，公司，营利性实体的雇员。 InDevR是ampliPHOX本文所述的技术商业化。
Acknowledgments
InDevR承认NIH / NIAID的U01AI070276和R43AI077112为这项工作提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR Inc. | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
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