Summary
비 - 파괴적인 볼륨 시각화는 가장 효율이 X - 선 마이크로 컴퓨터 tomography (CT) 어떤의 단층 기술에 의해 형성될 수 있습니다.
Abstract
비 - 파괴적인 볼륨 시각화는 가장 효율이 X - 선 마이크로 컴퓨터 tomography (μCT) 어떤의 단층 기술에 의해 형성될 수 있습니다.
고해상도 μCT 전직 생체내 생물 학적 샘플이 1, 2의 3D 심사 매우 다양한 아직 정확한 (해상도 1-2 미크론) 기술입니다. 마찬가지로 전자 tomography 반대, μCT 최대 4cm 두께의 샘플로의 시험을 수 있습니다. 조직학에 주에 비해이 기술은 측정에만 몇 시간이 필요합니다. 또한, μCT은 2D stereologic 모델에 의존하지 않습니다 따라서 그것은 보완 수 있으며 어떤 경우에는 심지어 두 시간을 소비하고 파괴 아르 histological 방법 3, 4를 바꿀 수 있습니다. μCT에서 샘플 컨디셔닝 및 위치는 간단하고 부정적인 구조에 영향을 미칠 수있는 고진공 또는 저온을 필요하지 않습니다. 샘플 위치 및 180 ° 또는 2 차원 이미지 촬영 각 각도 들어 신틸레이터하고 정확한 CCD 카메라를 포함 microfocused X - 선 소스와 검출기 사이에 360 °를 회전하고 전체 볼륨이 하나를 사용하여 복원입니다 다른 사용 가능한 알고리즘 5-7. 3D 해상도는 회전 단계의 감소와 함께 증가합니다. 현재 비디오 프로토콜 준비, 고정 및 높은 해상도에서 이미지 다음 샘플의 위치의 주요 단계를 보여줍니다.
Protocol
1. 샘플 준비
- 검사하는 조직을 추출 후, mineralized 조직은 악기에 위치하고 몇 군데 있습니다. 이미지에 마우스 대퇴골의 하나는 다음과 같은 단계를 따라야합니다 :
- C57/Bl6 배아 18.5 일 postceutus (E18.5)에서 생긴 다리를 게시 제거합니다.
- 에폭시 수지 또는 다른 접착제를 사용하여 폴리스티렌 피펫 팁 (20-200 μl)의 좁은 끝을 밀봉하고, 작업 버퍼 (PBS 또는 기타)와 팁을 입력합니다.
- 단단히 끝에 다리를 맞춤 및 parafilm 시트와 함께 다른 쪽 끝을 밀봉.
- 적당한 홀더에 피펫 팁을 놓고 제 3의 프로토콜을 따르십시오. 마우스 다리의 배아에서 대퇴골을 시각화 들어, 악기는 40 KV 200 μA로 설정됩니다. 8μ 해상도 4X 배율로 1,000 프로젝션 이미지 획득해야합니다.
- 비 mineralized 조직은 처음에는 많은 가능한 프로토콜 8,9 중 하나를 사용하여 관심있는 조직의 X - 선 감쇠를 증가하기 위해 고정 및 스테인드해야합니다. 쥐의 폐 및 이와 유사한 샘플은 준비 프로토콜은 다음과 같습니다 :
- 누드 쥐 폐에 비 작은 세포 폐 암종 (NSCLC) NCI - H460의 Orthotopical 주입
- 폐암의 nodules는 주입의 사주 감지되고 시작
- 쥐를 희생 즉시 헤파린과 혼합 생리 식염수로 달이다
- 기관지 순환을 얼룩이 좌심실에 Microfil (Flowtech)의 희석 용액 (복합 솔루션, 희석제 3 ML과 치료 요원의 0.3 ML 2 ML)의 그것을 주사
- 암흑의 폐, 심장의 압축을 풉니다
- 50 ML의 플라스틱 시험관에 단단히를 피팅하여 샘플을 (프로토콜 제 2 장 참조) 고정
- 옷감은 에탄올의 감쇠 튜브의 하단에 배치하여 포화 에탄올 분위기를 만들기
- 악기의 소지자에 접착제 또는 나사 튜브
- 이미징 매개 변수 (3 장)을 설정 진행합니다. 쥐의 폐의 완전한 이미지의 소스는 40KV 및 100 μA에서 설정됩니다. 16μ 해상도에 도달하기 위해서는 하나는 0.5x의 확대에 2,500 투영 이미지를 획득한다.
2. 샘플 고정
높은 해상도에서 측정하는 동안 시료 위치에 변화를 방지하는 것이 중요합니다. 이 경우, 샘플은 단단히 크기에 맞는 플라스틱받는 사람으로 고정됩니다. 폴리스티렌 피펫 팁, 플라스틱 파스퇴르 pipettes 또는 특별히 만든 플라스틱 소유자는 이러한 측면에 사용됩니다. 실험 요구 사항에 따라 샘플을 공중에 검사가 될 수도 있고 아니면 에탄올 또는 버퍼 솔루션에 열중. 일반 고정 및 악기의 마우스 배아의 다리의 최종 위치는 그림 1에 표시됩니다.
그림 1. 마이크로 중부 표준시 악기의 배아 마우스 다리의 최종 위치.
3. 수집 매개 변수를 설정 : X - 선 전압 및 전류, CCD의 노출 시간
- 홀더에 배치, 샘플은 악기의 순환 단계에 들어가게된다
- 첫 번째 X - 레이 이미지는 전압과 전류 임의로 세트로 이루어집니다.
- 이미지가 너무 어두운 경우, 하나 먼저 광자의 수를 증가해야하므로 전류를 조금 향상시킬 수 있습니다. 이 충분하지 않다면, 하나는 약간 X - 선 광자의 에너지를 증가해야 X - 선관의 전압을 즉.
- 이미지가 너무 밝은 경우, 하나는 먼저 현재의 후, 전압을 감소한다.
- 이미지의 밝기는 비닝 증가 수 있습니다. 2 비닝은 2x2 픽셀의 각 행렬의 합계 소요 반면 1 비닝는 계정에 이미지에서 각 픽셀의 강도 걸립니다. 이미지 비닝 1의 경우보다 약 4 배 밝게되지만, 절반 해상도를합니다.
- 최적의 밝기를 설정 후, 하나는 한쪽 다른 쪽 실험의 합리적인 기간에 최고의 명암 사이의 타협으로 카메라의 노출 시간을 최적화할 수 있습니다.
- 특히 낮은 흡수 샘플 이미지의 대비는 주로 그 낮은 에너지 광자의 광자 흐름을 감소 필터를 사용하여 향상시킬 수 있습니다.
4. 샘플 위치
- 작업 배율을 선택합니다. 가능한 선택은 0.5x 4X, 10X, 20x 및 40x 있습니다. 보기의 필드는 증가 배율로 감소하게된다.
- X - 선 소스와 샘플 사이 예제와 검출기 사이의 거리를 설정하여보기의 최적 해상도와 필드를하십시오. 샘플 거리에 소스를 증가하는 것은보기의 필드를 감소하고 해상도를 증가시킵니다. 검출기 거리에 샘플은 반대 효과가 있습니다.
3D로 볼 수 있도록 전체 필드에 존재해야합니다모든 각도에서 투영 이미지. 하나는 여러 각도에서 샘플을 회전하여 가능한 한 가까이 가능한 회전축에 샘플을 가져하여이 문제를 확인해야합니다. 이를 위해, 하나는 다음과 같은 단계를 따라야합니다 :
- 0 데그에서 이미지를 가지고, 그리고 -20 데그에서 샘플을 돌린다. 원하는 볼륨이 옆으로 옮겨있다면, 하나는 회전 축을 위치 조정하여 위치를 수정해야합니다.
- 보정 후, 샘플은 다른 각도로 회전 수 있으며, 관심 분야는 -90에서 90 데그 모든 각도에서 이미지를 내부 때까지 위치, 다시 수정.
5. 고해상도 tomogram
- 측정하는 동안, 샘플 한 번에 작은 각도에 의해 각각의 각도를 한 투영 이미지의 회전은 이미 사용 중입니다. 이미지의 총수는 항상 한쪽에 원하는 해상도와 다른 측면에서 측정 및 파일 크기의 시간 사이의 타협이다. 마찬가지로 Fig.2에 나타난 모든 단일 프로젝션이 샘플의 모든 조각이 다른 이상 한 superposed, 따라서 샘플의 3 차원 구조를 밝힐 수 있습니다.
그림 2. 0 ° (A), 45 ° (B)와 90 ° (C) 회전 각도로 쥐의 폐의 투영 이미지.
- 단지 최소한 -90 90 데그 사이에 투영 이미지를 복용 후, 하나는 샘플 볼륨의 재건을 진행할 수 있습니다. 재건 사용되는 소프트웨어와 예측의 수에 따라 10 분 2 시간 사이에 걸립니다. 다시 말하지만, 3D 이미지의 최종 품질은 원하는 해상도와 하나 보내고 싶어 시간과 결과 파일의 크기 사이의 타협이다.
6. 이미지 스케일 교정
재건축 이미지 픽셀 수준 (값)은 그 이미지에 대해 고유합니다. 서로 다른 두 가지 이미지를 비교하기 위해 고유의 강도 규모는 각 이미지에 부과되어야한다. 이를 위해
- 샘플과 동일한 실험 조건을 사용하여 표준 팬텀과 tomography를 실행
- 팬텀에 대해 얻은 값을 사용하여 샘플 이미지를 재조정. 가장 일반적인 규모 브라 (또는 CT) 규모이다. 4X 확대를위한 15,000의 배경 값은 (물 또는 PBS)을 0으로 대체되었으며 뼈에 35000의 최대 값은 3000의 표준 브라 가치로 대체되었습니다. 기타 픽셀 값을 그 한계에 따라 선형 보간이나 추정의 결과.
7. 이미지 프로세싱 및 분석
고해상도 이미지를 얻기 후에, 하나는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관련 정보를 추출한다. 사용하는 소프트웨어 패키지는 매우 큰 파일 (최대 20GB까지)와 함께 작동하도록 설계되어야합니다.
8. 대표 결과
배아 일 18.5 (E18.5)에 C57/Bl6 마우스에서 대퇴골의 표현 - 포 일 mineralization 프로세스의 개시 이후는 그림 3에 표시됩니다. 부드러운 조직이 준비에서 보이지 않는 동안 미네랄 레이어 (흰색) 명확하게 볼 수 있습니다. 우리는 4X의 선형 배율로 1,000 투영 이미지를했습니다. 최종 해상도는 8 미크론입니다. Fig.1에 표시된 볼륨 렌더링의주의 분석, 뼈 부피 분율 (mineralized 조직에 의해 점유되는 뼈 볼륨의 분율)가 0.18임을 보여줍니다, 그리고 뼈 미네랄 밀도는 723 MG / cm 3. 그 가치는 우리 개발의 다른 단계에 뼈를이 구조를 비교할 수 있습니다.
그림 3. 마우스 대퇴골의 배아의 3D 이미지의 다른 표현. 횡단하는 (단면)는 (A), sagital (메디오 - 측면)과 (B)와 볼륨 렌더링 (C)의 스냅샷이 표시됩니다.
그림 4는 비 작은 세포 폐 암종 (NSCLC) NCI - H460과 함께 orthotopically 이식 12 주 된 여성 누드 쥐 (RNU)의 폐의 3D 이미지를 보여줍니다. 2,500 프로젝션 이미지 16 미크론의 최종 해상도를 확보, 0.5x의 선형 배율로 촬영했다. 이미지가 Microfil 스테인드 혈관 (아래 20 미크론의 직경)를 보여줍니다. 이미지 분석 사주 주입 후 여러 암 nodules가 형성되는 것을 보여줍니다. 그들은 폐 볼륨 (17 %)의 상당 부분을 덮고있다. 폐동맥 얼룩의 대부분은 종양의 주변 지역에서 발견되었다. 크게로 그림 4B와 같이, 여러 혈관들은 볼륨의 일부 3% 예비 분석에 따르면, 덮고, nodules 안에도 존재하고 있습니다.
그림 4. 암 nodules의 3D 이미지가 쥐를에서 성장폐. 볼륨 렌더링 (A)와 볼륨 (B)를 통해 섹션의 스냅샷이 표시됩니다. 암 nodules는 화살표로 표시됩니다.
영화 1. 그림 1에서 마우스 대퇴골의 볼륨 렌더링. 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2. 그림 2에서 쥐의 폐의 볼륨 렌더링. 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 3. 호흡을 통해 시리얼 섹션. nodules은 조각의 대부분의 회색 영역으로 표시됩니다. 동영상을 시청하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
배아 일 18.5 (E18.5)에서 C57/Bl6 마우스 나흘 mineralization 프로세스의 개시 이후입니다. 개발이 단계에서, 미래의 뼈가 명확하게 그림 3에서 볼, mineralized osteoids 여러 레이어로 만들어진 것입니다. 이 시점에서, 하나는 mineralized 조직이 적은 시료 처리를 필요로 다른 악기와 낮은 해상도로 시각 수 있습니다 강조해야한다. 높은 해상도를 제공하는 외에 현재 프로토콜 (및 마이크로 중부 표준시 악기가 사용)은 측정을위한 최고의 기하학적 매개 변수를 선택하는 사용자에 대한 높은 유연성을 제공합니다.
그림 4 결과 orthotopic 폐암 동물 모델에서 인간이 아닌 작은 세포 폐암이 혈관과 neovascularization 모집을 일으킬 수 보여줍니다. 우리는 폐 조직이 둘 다 이동하지라고 생각하거나 그 모양은 측정하는 동안 변경되었습니다. 사용자는 tomography 동안 이러한 변화를 피하기 위해 특별한주의 정도 소요됩니다. 일부 샘플, 특히 부드럽고 조직을 위해, 하나는 측정하는 동안 완벽하게 샘플을 고정 특별한 개최 장치를 구축해야한다. 불행히도 종양의 주변에 대비 요원의 높은 leakages의 존재는 말초 혈관의 신뢰성 부량하지 못했습니다. 결과적으로 이미지가 명확 영화 2, 3에 존재하는, 특히 가장자리에서 일부 얼룩 에이전트에 의해 오염됩니다. 우리는이 누설을 막을 수는 있겠지만, 그들의 크기, 모양 및 내부 혈관의 존재를 포함하여 암 nodules에 대한 유용한 정보는 영향을받지되었습니다. 우리는 분명히 적어도 이곳에서 공부했던 기관지 순환, 말초 혈액 공급이 종양 내부의 일부 재관류로, 종양 재관류에 현재 참여하고 결론 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
연구는 어빙과 과학의 웨이즈만 연구소에서 나노 및 바이오 나노 이미징을위한 체르나 Moskowitz 센터에서 실시되었다.
우리는이 프로토콜을 설계 및 실행하는 그녀의 도움을 Orna Yeger에 감사하고 있습니다.
Materials
| For image acquisition we have used a MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographic system produced by Xradia, Concord, USA. | |||
| Images were processed and analyzed using ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, France) and MicroView (General Electric, USA) software packages. Any available image analysis software can be used instead |
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