ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT

Summary

Non-הרסני להדמיה נפח יכולה להיות מושגת רק על ידי טכניקות טומוגרפית, מתוכם היעילה ביותר היא טומוגרפיה רנטגן מיקרו ממוחשבת (CT).

Abstract

Non-הרסני להדמיה נפח יכולה להיות מושגת רק על ידי טכניקות טומוגרפית, מתוכם היעילה ביותר היא טומוגרפיה רנטגן מיקרו ממוחשב (μCT).

רזולוציה גבוהה μCT הוא מאוד תכליתי עדיין מדויק (1-2 מיקרון של רזולוציה) טכניקה לבדיקה 3D של ex-vivo דגימות ביולוגיות ^{1, 2.} בניגוד האלקטרון טומוגרפיה, μCT מאפשר בחינה של עד 4 ס"מ דגימות עבה. טכניקה זו דורשת שעות ספורות בלבד המדידה לעומת שבועות היסטולוגיה. בנוסף, μCT אינו מסתמך על מודלים stereologic 2D, ובכך היא עשויה להשלים ובמקרים מסוימים יכולים אפילו להחליף שיטות היסטולוגית ^{3, 4,} אשר שניהם זמן רב והרסני. מיזוג לדוגמה ומיצוב ב μCT היא פשוטה ואינה דורשת ואקום גבוה או בטמפרטורות נמוכות, דבר שעלול להשפיע לרעה על המבנה. המדגם ממוקם וסובב 180 ° או 360 ° בין מקור רנטגן microfocused וגלאי, הכולל scintillator ומצלמה מדויק CCD, עבור כל זווית תמונה 2D נלקח, ולאחר מכן את עוצמת כולו משוחזר באמצעות אחד של אלגוריתמים שונים הזמינים ^5-7. ההחלטה 3D עולה עם ירידה של שלב הרוטציה. פרוטוקול וידאו הנוכחית מציגה את הפעולות העיקריות immobilization הכנה, ואת המיקום של המדגם ואחריו הדמיה ברזולוציה גבוהה.

Protocol

1. לדוגמא הכנה

1. לאחר חילוץ רקמות אשר יש לבחון, רקמות mineralized ניתן למקם במכשיר הדמיה. כדי תמונה אחת הירך העכבר צריך לבצע את השלבים הבאים:
   1. הסרה של פוסט מורטם רגל מעובר C57/Bl6 18.5 ימים postceutus (E18.5).
   2. חותם את הקצה הצר של טיפ פוליסטירן פיפטה (2-20 μl) באמצעות שרף אפוקסי או דבק אחר, ולמלא את קצה למאגר עם עובד (PBS או אחר).
   3. Fit בחוזקה את הרגל לתוך קצה וסוגרים את הקצה השני עם סדין parafilm.
   4. הניחו את קצה פיפטה לתוך המחזק מתאים ובצע את פרוטוקול מן הפרק 3. בשביל לדמיין את עצם הירך של העובר רגל עכבר, המכשיר מוגדר 40 ו 200 KV μA. עבור 1000 תמונות ברזולוציה 8μ הקרנה עם הגדלה 4x להיות נרכשת.
2. Non-mineralized רקמות צריך להיות קבוע בתחילה ומוכתמת על מנת להגדיל את הנחתה רנטגן של רקמת עניין באמצעות אחד הפרוטוקולים הזמינים רבים ^8,9. עבור לריאות עכברוש דגימות דומה, פרוטוקול הכנה היא:
   1. ההשתלה Orthotopical הלא סרטן ריאות קטנים (NSCLC) NCI-H460 על הריאות עכברוש בעירום
   2. סרטן ריאות גושים להתחיל להיות לגילוי 4 שבועות מן ההשתלה
   3. הקורבן עכברוש ומיד להחדיר אותו עם תמיסת מלח מעורבב עם הפרין
   4. הזרק את זה עם פתרון מדוללת של Microfil (Flowtech), (2 מ"ל של תמיסת התרכובת, 3 מ"ל של diluent ו 0.3 מ"ל של סוכן ריפוי) לתוך החדר השמאלי להכתים את זרימת הסימפונות
   5. חלץ את הריאות והלב של החולדה
   6. לשתק את המדגם (ראה פרק 2 של הפרוטוקול) על ידי הולם בחוזקה לתוך שפופרת 50 מ"ל מבחן פלסטיק
   7. יצירת אווירה אתנול רווי ידי הצבת על החלק התחתון של הצינור מטלית דיכא באתנול
   8. דבק או בורג המחזיק את הצינורית של המכשיר
   9. המשך עם הגדרת הפרמטרים הדמיה (פרק 3). עבור הדמיה מלאה של הריאות עכברוש מקור מוגדר 40KV ו 100 μA. כדי להגיע לפתרון 16μ יש לרכוש 2500 הקרנת תמונות בהגדלה של 0.5x.

2. לדוגמה immobilization

ברזולוציה גבוהה, חשוב להימנע מכל שינוי בעמדה מדגם במהלך המדידה. לשם כך, המדגם הוא קבוע בחוזקה אל הנמען פלסטיק שמתאים לגודלה. פיפטה פוליסטירן טיפים, פלסטיק pipettes פסטר או מחזיקי הפלסטיק שנבנה במיוחד משמשים בהקשר זה. על פי דרישות הניסוי, המדגם ניתן לבדוק באוויר או שקועים פתרונות אתנול או בולם. Immobilization אופיינית והמיקום הסופי של הרגל של העובר העכבר המכשיר מוצג באיור 1.

באיור 1. המיקום הסופי של הרגל עכבר עובריים במכשיר מיקרו CT.

3. הגדרת פרמטרים הרכישה: רנטגן המתח והזרם, CCD זמן חשיפה

1. מכניסים בעל, המדגם הוא לשים בשלב סיבוב של המכשיר
2. תמונה ראשונה רנטגן הוא נלקח עם המתח והזרם לקבוע באופן שרירותי.
3. אם התמונה כהה מדי, צריך להגדיל את מספר הפוטונים הראשונה, כך להגדיל קצת הנוכחית. אם זה לא מספיק, צריך להגדיל קצת את האנרגיה של קרינת רנטגן פוטונים, כלומר מתח על שפופרת רנטגן.
4. אם התמונה היא בהירה מדי, אחד צריך קודם להקטין את המתח, ואז הנוכחי.
5. הבהירות של התמונה ניתן להגדיל על ידי binning. Binning של 1 לוקח בחשבון את האינטנסיביות של כל פיקסל בתמונה, בעוד binning של 2 לוקח את הסכום של כל מטריצה ​​של 2x2 פיקסלים. התמונה יהיה כ 4 פעמים בהירים יותר במקרה של binning 1, אבל תהיה במחצית החלטה.
6. לאחר הגדרת הבהירות האופטימלית, צריך לייעל את זמן החשיפה של המצלמה כדי פשרה בין הניגוד הטוב בצד אחד משך זמן סביר של הניסוי בצד השני.
7. הניגוד של תמונות, במיוחד של דגימות קליטת נמוכה, ניתן לשפר באמצעות מסננים, אשר להפחית את השטף פוטון, בעיקר זו של פוטונים אנרגיה נמוכה יותר.

4. לדוגמא מיצוב

1. בחר את ההגדלה עובד. בחירות אפשריות הן 0.5x, 4x, 10x, 20x ו 40X. שדה הראיה יורדת עם הגדלת הגדלה.
2. קבל את ההחלטה בתחום אופטימלי של השקפה על ידי קביעת המרחק בין מקור קרני רנטגן לבין מדגם בין המדגם גלאי. הגדלת המרחק מדגם מקור מקטין את שדה הראיה ומגדיל את הרזולוציה. לדוגמה למרחק גלאי יש השפעה הפוכה.

שדה שלם כדי לצפות ב-3D ​​צריך להיות נוכחהקרנת תמונה בכל הזוויות. אחד צריך לבדוק זאת על ידי החלפה של מדגם בזוויות שונות ועל ידי הבאת מדגם קרוב ככל האפשר לציר הסיבוב. לשם כך, יש לבצע את השלבים הבאים:

3. קח תמונה ב 0 מעלות, ולאחר מכן לסובב את המדגם ב -20 מעלות. אם עוצמת השמע הרצויה השתנה רוחבית, יש לתקן את מעמדה על ידי למקם מחדש את ציר הסיבוב.
4. לאחר תיקון, המדגם הוא לסובב בזווית אחרת בעמדה תיקן שוב, עד השדה של הריבית בתוך התמונה בכלל זוויות מ -90 עד 90 מעלות.

5. ברזולוציה גבוהה tomogram

1. במהלך המדידה, המדגם הוא מסובב בזווית קטנה בכל פעם, כל אחד על התמונה זווית ההקרנה היא נלקחה. המספר הכולל של תמונות היא תמיד פשרה בין הרזולוציה הרצויה מצד אחד הזמן של המדידה ואת גודל הקובץ בצד אחר. כפי שמוצג Fig.2, כל הקרנת כוללת את כל פרוסות במדגם superposed אחת על פני אחרת, ולכן לא ניתן לחשוף את מבנה 3D של המדגם.

איור 2. הקרנת תמונות של ריאות של חולדה ב 0 ° (א), 45 ° (ב) ו - ° 90 (ג) זווית הסיבוב.

2. רק לאחר לקיחת תמונות הקרנת לפחות בין 90 ו -90 מעלות, אפשר להמשיך מחדש של היקף המדגם. השיקום לוקח בין 10 דקות ו - 2 שעות, תלוי של התוכנה בשימוש של מספר תחזיות. שוב, איכות התמונה הסופית של 3D הוא פשרה בין הרזולוציה הרצויה הזמן אחד לא רוצה לבלות את גודל הקובץ שהתקבל.

6. סולם תמונה וכיול

רמת פיקסל (ערך) של התמונה המשוחזרת היא ייחודית עבור התמונה. על מנת להשוות שתי תמונות שונות, סולם עוצמת ייחודי צריך להיות מוטל על כל תמונה. בשביל זה

1. הפעל טומוגרפיה עם רוח רפאים תקן באמצעות תנאי הניסוי זהה למדגם
2. לכייל מחדש את התמונה מדגם באמצעות הערכים שהתקבלו הפנטום. קנה המידה הנפוץ ביותר הוא סולם (או CT) Hounsfield. עבור הגדלה 4x הערך הרקע של 15,000 (מים או PBS) הוחלף 0 ואת הערך המרבי של 35,000 עבור העצם הוחלף הערך Hounsfield הסטנדרטי של 3000. ערכים פיקסל אחרים נבעה אינטרפולציה אקסטרפולציה ליניארית או על בסיס גבולות אלה.

7. תמונה עיבוד וניתוח

לאחר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה, צריך לחלץ מידע רלוונטי באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. חבילת התוכנה כדי לשמש צריך להיות מתוכנן לעבוד עם קבצים גדולים מאוד (עד 20GB).

8. נציג תוצאות

ייצוג של עצם הירך של העכבר C57/Bl6 ביום עובריים 18.5 (E18.5) - ארבעה ימים לאחר תחילת תהליך מינרליזציה מוצג באיור 3. שכבות מינרלים גלויים לעין (לבן), בעוד הרקמות הרכות אינם גלויים כהכנה זה. לקחנו 1000 הקרנת תמונות עם הגדלה ליניארי של 4x. ההחלטה הסופית היא 8 מיקרון. ניתוח זהיר של טיוח נפח שמוצג תמונה 1, עולה כי נפח העצם חלק (החלק היחסי של נפח העצם כי היא נכבשה על ידי רקמת mineralized) הוא 0.18, ואת צפיפות העצם היא 723 מ"ג / ס"מ ^3. ערכים אלה מאפשרים לנו להשוות את המבנה הזה עם העצמות בשלבים אחרים של פיתוח.

איור 3. ייצוגים שונים של דימוי 3D של עובר הירך העכבר. (חתך) משוכל (א), בסעיף sagital (מדיו, לרוחב) (ב ') תמונה של טיוח נפח (ג) מוצגים.

איור 4 מראה תמונה 3D של הריאות של עכברוש עירום נשי (RNU), 12 שבועות, מושתל orthotopically עם סרטן ריאות שאינם קטנים (NSCLC) NCI-H460. 2500 הקרנת תמונות צולמו עם הגדלה של 0.5x ליניארי, הבטחת החלטה סופית של 16 מיקרון. התמונה מראה את כלי הדם Microfil מוכתם (עד קוטר 20 מיקרון). ניתוח התמונה עולה כי 4 שבועות לאחר ההשתלה, גושים סרטניים רבים נוצרים. הם כיסוי חלק משמעותי של נפח ריאות (17%). רוב מכתים הריאה נמצא בפריפריה של גידולים. באופן מובהק, כפי שמוצג 4B תאנה, כלי הדם נמצאים גם כמה בתוך גושים, מכסה, על פי ניתוח ראשוני של 3% כמה נפח שלהם.

איור 4. תמונת 3D של גושים סרטניים הגדלים חולדההריאות. תמונה של טיוח נפח (א) ו - קטע דרך נפח (B) מוצגים. גושים סרטניים מסומנים בחיצים.

סרט 1. טיוח נפח של עצם הירך העכבר באיור 1. לחץ כאן כדי לראות את הסרט.

סרט 2. טיוח נפח הריאות עכברוש באיור 2. לחץ כאן כדי לראות את הסרט.

סרט 3. סעיפים Serial דרך הריאות. גושים להופיע באזורים האפורים ביותר של הפרוסות. לחץ כאן כדי לראות את הסרט.

Discussion

C57/Bl6 עכבר ביום עובריים 18.5 (E18.5) הוא ארבעה ימים לאחר תחילת תהליך מינרליזציה. בשלב זה של הפיתוח, עצם את העתיד עשוי שכבות רבות של osteoids mineralized, לראות בבירור באיור 3. בשלב זה, יש להדגיש כי רקמות mineralized ניתן דמיינו ברזולוציה נמוכה יותר עם מכשירים שונים אשר דורשים טיפול מדגם פחות. הפרוטוקול הנוכחי (ואת מכשיר ה-CT מיקרו להשתמש בו) מלבד מתן רזולוציה גבוהה יותר, מציע את הגמישות הגבוהה ביותר עבור המשתמש לבחור את הפרמטרים גיאומטריות הטוב ביותר עבור המדידה.

תוצאות באיור 4 מראים כי סרטן הדגמים orthotopic ריאה מן החי, האדם ריאות שאינם קטנים סרטן תאים יכול לגרום גיוס של כלי הדם neovascularization. אנו רואים כי רקמת הריאה לא התרגש, וגם יש לו את צורתו השתנתה במהלך המדידה. המשתמש צריך לנקוט באמצעי זהירות מיוחדים כדי למנוע שינויים כאלה במהלך טומוגרפיה. לקבלת דוגמיות מסוימים, במיוחד ברקמה רכה, יש לבנות מכשירים מחזיק מיוחד לשתק לחלוטין את המדגם במהלך המדידה. למרבה הצער הנוכחות של דליפות גבוהות של חומר ניגוד בסביבה של גידולים מנעו כימות אמין של כלי הדם ההיקפיים. כתוצאה מכך התמונות נגועים על ידי סוכן כמה מכתים במיוחד בקצוות, וזו ללא ספק מתנה בסרטים 2 ו -3. לא יכולנו למנוע את זה לשפוך, אבל מידע שימושי על גושים סרטן, כולל הגודל, הצורה ואת הנוכחות של כלי הדם הפנימית לא נפגעה. אנחנו יכולים להסיק בבירור כי לפחות במחזור הסימפונות אשר נחקרה כאן, אספקת הדם ההיקפיים משתתף זלוף הגידול, עם טפטוף כמה נוכח גם בתוך הגידול.

Materials

For image acquisition we have used a MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographic system produced by Xradia, Concord, USA.

Images were processed and analyzed using ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, France) and MicroView (General Electric, USA) software packages. Any available image analysis software can be used instead