3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

Summary

No destructivos visualización de volumen sólo se puede lograr por medio de técnicas tomográficas, de los cuales el más eficiente es la tomografía de rayos X micro computarizada (TC).

Abstract

No destructivos visualización de volumen sólo se puede lograr por medio de técnicas tomográficas, de los cuales el más eficiente es la tomografía de rayos X micro computarizado (μCT).

De alta resolución μCT es muy versátil y precisa (1-2 micras de resolución) técnica para su examen en 3D de la ex-vivo de muestras biológicas ^{1, 2.} A diferencia de tomografía electrónica, el μCT permite el examen de hasta 4 cm de espesor muestras. Esta técnica requiere sólo unas pocas horas de la medición con respecto a las semanas en la histología. Además, μCT no se basa en los modelos 2D estereológica, por lo que pueden complementar y en algunos casos puede incluso sustituir a los métodos histológicos ^{3, 4,} que son a la vez lento y destructivo. Acondicionamiento de la muestra y el posicionamiento en μCT es sencillo y no requiere de alto vacío o bajas temperaturas, que pueden afectar negativamente a la estructura. La muestra se coloca y se gira 180 º o 360 º entre un microfocused fuente de rayos X y un detector, que incluye un contador de centelleo y una precisa cámara CCD, para cada ángulo se toma una imagen en 2D, y luego todo el volumen se reconstruye con un de los algoritmos disponibles diferentes ^5-7. La resolución en 3D aumenta con la disminución de la etapa de rotación. El protocolo de vídeo actual muestra los principales pasos en la preparación, la inmovilización y el posicionamiento de la muestra seguido de imágenes en alta resolución.

Protocol

1. Preparación de la muestra

1. Después de extraer el tejido que ha de ser examinado, los tejidos mineralizados se puede colocar en el instrumento y la imagen. A la imagen del ratón un fémur deben seguir los siguientes pasos:
   1. Quitar mensaje pierna mortem de un embrión C57/Bl6 postceutus 18,5 días (E18.5).
   2. Selle el extremo angosto de una punta de pipeta de poliestireno (20-200 l) con una resina epoxi o pegamento otro, y llenar la punta con el tampón de trabajo (PBS u otro).
   3. Ajustar bien la pierna en la punta y sellar el otro extremo con la hoja de parafilm.
   4. Coloque la punta de la pipeta en un soporte adecuado y seguir el protocolo del capítulo 3. Para visualizar el fémur de la pierna del embrión del ratón, el instrumento se encuentra en 40 KV y 200 mA. Para 8μ resolución 1000 imágenes de proyección de 4 aumentos tienen que ser adquiridos.
2. No mineralizado tejidos tienen que ser fijado inicialmente y se tiñen con el fin de aumentar la atenuación de rayos X del tejido de interés mediante el uso de uno de los muchos protocolos disponibles ^8,9. Para los pulmones de ratas y muestras similares, el protocolo de preparación es la siguiente:
   1. Implantación de Orthotopical no carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM) NCI-H460 en pulmones de ratas desnudas
   2. Nódulos de cáncer de pulmón comenzará a ser detectable cuatro semanas desde la implantación
   3. Sacrificio de las ratas y de inmediato se infunden con una solución salina mezclada con heparina
   4. Inyectar con una solución diluida de Microfil (Flowtech), (2 ml de solución de compuesto, 3 ml de diluyente y 0,3 ml de agente de curado) en el ventrículo izquierdo a la mancha de la circulación bronquial
   5. Extracto de los pulmones y el corazón de la rata
   6. Inmovilizar la muestra (véase el capítulo 2 del protocolo) mediante el ajuste de la fuerza en un tubo de plástico de 50 ml
   7. Crear una atmósfera saturada de etanol mediante la colocación en la parte inferior del tubo de un paño humedecido en etanol
   8. Pegamento o tornillos del tubo en un soporte del instrumento
   9. Continuar con la configuración de los parámetros de imagen (capítulo 3). Para la imagen completa de los pulmones de ratas de la fuente se establece en 40kV y 100 mA. Con el fin de alcanzar una resolución 16μ uno tiene que adquirir 2.500 imágenes de proyección con un aumento de 0.5x.

2. Muestra de la inmovilización

En alta resolución, es importante para evitar cualquier cambio en la posición de la muestra durante la medición. Para ello, la muestra está fuertemente fijado en un recipiente de plástico que se ajusta a su tamaño. Puntas de pipeta de poliestireno, plástico pipetas Pasteur o construidas especialmente para los titulares de plástico se utilizan en este sentido. De acuerdo a los requerimientos experimentales, la muestra puede ser examinada en el aire o inmersas en soluciones de etanol o de amortiguamiento. Inmovilización típicos y la colocación final de la etapa de embrión de ratón en el instrumento se muestra en la Fig. 1.

Figura 1. La colocación final de la pierna de embriones de ratón en el instrumento micro CT.

3. Establecer los parámetros de adquisición: rayos X de tensión y corriente, CCD tiempo de exposición

1. Colocado en un soporte, la muestra se coloca en la fase de rotación del instrumento
2. Una primera imagen de rayos X se toma con el voltaje y la corriente arbitrariamente.
3. Si la imagen es demasiado oscura, se debe aumentar el número de fotones en primer lugar, para aumentar un poco la corriente. Si esto no es suficiente, hay que aumentar un poco la energía de los fotones de rayos X, es decir, la tensión en el tubo de rayos X.
4. Si la imagen es demasiado brillante, lo primero que debe disminuir la tensión, entonces la corriente.
5. El brillo de la imagen se puede aumentar por hurgar en la basura. Hurgar en la basura de uno tiene en cuenta la intensidad de cada píxel de la imagen, mientras que hurgar en la basura de los dos toma la suma de cada matriz de píxeles de 2x2. La imagen es de 4 veces más brillante que en el caso de binning 1, sino que tendrá la mitad de la resolución.
6. Después de ajustar el brillo óptimo, hay que optimizar el tiempo de exposición de la cámara a un compromiso entre el mejor contraste de un lado y una duración razonable de la experiencia en otro lado.
7. El contraste de las imágenes, en especial de las muestras de baja absorción, se puede mejorar mediante el uso de filtros, que reducen el flujo de fotones, principalmente la de los fotones de menor energía.

4. Ejemplo de posicionamiento

1. Elija el aumento de trabajo. Las opciones posibles son 0,5 x, 4x, 10x, 20x y 40x. El campo de visión disminuye con el aumento cada vez mayor.
2. Obtener la mejor resolución y campo de visión mediante el establecimiento de las distancias entre la fuente de rayos X y de la muestra y entre la muestra y el detector. El aumento de la distancia a la fuente de la muestra se reduce el campo de visión y aumenta la resolución. Muestra la distancia del detector tiene el efecto contrario.

Todo el campo para ser visto en 3D debería estar presente en laproyección de la imagen en todos los ángulos. Se debe comprobar esto por la rotación de la muestra en diferentes ángulos y por traer la muestra lo más cerca posible al eje de rotación. Para ello, se deben seguir los siguientes pasos:

3. Tomar una imagen a 0 grados, y luego girar la muestra a -20 grados. Si el volumen deseado se ha desplazado lateralmente, se debe corregir su posición mediante el reposicionamiento del eje de rotación.
4. Después de la corrección, la muestra se va a girar en otro ángulo y la posición corregida de nuevo, hasta que el campo de interés dentro de la imagen en todos los ángulos desde -90 hasta 90 grados.

5. Tomografía de alta resolución

1. Durante la medición, la muestra se gira un pequeño ángulo a la vez y en cada imagen el ángulo de proyección uno se toma. El número total de imágenes es siempre un compromiso entre la resolución deseada en un lado y el momento de la medición y el tamaño del archivo en otro lado. Como se muestra en la figura 2, cada proyección individual incluye todos los cortes en la muestra superpuestos uno sobre otro, y por lo tanto no puede revelar la estructura 3D de la muestra.

Figura 2. Imágenes de la proyección de los pulmones de ratas a los 0 ° (A), 45 º (B) y 90 ° (C) el ángulo de rotación.

2. Sólo después de tomar imágenes de proyección por lo menos entre -90 y 90 grados, se puede proceder a la reconstrucción del volumen de muestra. Reconstrucción tarda entre 10 minutos y 2 horas, dependiendo del software utilizado y el número de proyecciones. Una vez más, la calidad final de la imagen 3D es un compromiso entre la resolución deseada y el tiempo que se quiere gastar y el tamaño del archivo resultante.

6. Imagen de calibración de la báscula

El nivel de pixel (valor) en una imagen reconstruida es único para esa imagen. Con el fin de comparar dos imágenes diferentes, una escala de intensidad única tiene que ser impuestas a cada imagen. Por esta

1. Ejecutar una tomografía con un estándar de fantasma con las mismas condiciones experimentales que para la muestra
2. Vuelva a calibrar la imagen de muestra con los valores obtenidos para el fantasma. La escala más común es el Hounsfield (o CT) escala. De 4 aumentos el valor del fondo de 15.000 (de agua o PBS) fue reemplazado por 0 y el valor máximo de 35.000 para que el hueso fue sustituido por el estándar de valor Hounsfield de 3000. Otros valores de píxeles el resultado de la interpolación lineal o la extrapolación sobre la base de esos límites.

7. Procesamiento de imágenes y análisis

Después de obtener imágenes de alta resolución, se tiene que extraer la información relevante mediante el uso de software de análisis de imagen. El paquete de software que se utiliza tiene que ser diseñado para trabajar con archivos de gran tamaño (hasta 20GB).

8. Resultados representante

Una representación de un fémur de un ratón C57/Bl6 en el día embrionario 18.5 (E18.5) - cuatro días después del inicio del proceso de mineralización se muestra en la Fig. 3. Las capas de mineral son claramente visibles (blanco), mientras que los tejidos blandos no son visibles en esta preparación. Tomamos 1000 imágenes de proyección con un aumento lineal de 4x. La resolución final es de 8 micras. Un análisis cuidadoso de la representación de volumen se muestra en la Fig. 1, muestra que la fracción de volumen de hueso (la fracción del volumen del hueso que está ocupado por tejido mineralizado) es de 0,18, y la densidad mineral ósea es de 723 mg / cm ^3. Estos valores nos permiten comparar esta estructura con los huesos en otras etapas de desarrollo.

Figura 3. Representaciones diferentes de una imagen en 3D de un embrión de ratón fémur. El (sección transversal) transversal (A), la sagital (medio-lateral) sección (B) y una fotografía de la representación de volumen (C) se muestran.

La Figura 4 muestra una imagen en 3D de los pulmones de una rata hembra desnuda (RNU), 12 semanas de edad, implantada ortotópicamente con carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM) NCI-H460. 2500 imágenes de proyección se tomaron con un aumento lineal de 0,5 x, lo que garantiza una resolución final de 16 micras. La imagen muestra los vasos Microfil manchadas de sangre (hasta un diámetro de 20 micras). El análisis de la imagen muestra que cuatro semanas después de la implantación, el cáncer de los nódulos múltiples se forman. Que están cubriendo una parte importante del volumen pulmonar (17%). La mayoría de las manchas pulmonar se encuentran en las zonas periféricas de los tumores. De manera significativa, como se muestra en la Fig. 4B, varios buques de sangre están presentes también en el interior de los nódulos, que abarca, según el análisis preliminar de un 3% de su volumen.

Figura 4. Imagen en 3D de los nódulos de crecimiento del cáncer en las rataspulmón. Una instantánea de la representación de volumen (A) y una sección a través del volumen (B) se muestran. El cáncer de los nódulos están marcados con flechas.

Movie 1. Renderización de volumen del fémur del ratón en la figura 1. Haga clic aquí para ver la película.

Movie 2. Renderización de volumen de los pulmones de ratas en la Figura 2. Haga clic aquí para ver la película.

Movie 3. Las secciones seriadas a través de los pulmones. Los nódulos aparecen como zonas grises en la mayoría de los cortes. Haga clic aquí para ver la película.

Discussion

C57/Bl6 del ratón en el día embrionario 18.5 (E18.5) es cuatro días después del inicio del proceso de mineralización. En esta etapa de desarrollo, el hueso del futuro está hecha de muchas capas de osteoids mineralizada, ve claramente en la figura 3. En este punto, hay que destacar que los tejidos mineralizados se puede visualizar en una resolución más baja, con diferentes instrumentos que requieren menos manipulación de las muestras. El protocolo actual (y el instrumento de micro CT utilizados en ella), además de proporcionar mayor resolución, ofrece la máxima flexibilidad para el usuario para elegir los mejores parámetros geométricos de la medida.

Resultados de la figura 4 muestran que en los modelos animales de cáncer de pulmón ortotópico, humanos no pequeñas de cáncer de pulmón de células puede inducir a la contratación de los vasos sanguíneos y neovascularización. Consideramos que el tejido pulmonar se trasladó tampoco, ni ha cambiado su forma durante la medición. El usuario debe tomar precauciones especiales para evitar estos cambios en una tomografía. Para algunas muestras, especialmente para los tejidos blandos, hay que construir dispositivos de sujeción especiales que inmovilizan perfectamente la muestra durante la medición. Por desgracia, la presencia de fugas de alta de agente de contraste en el entorno de los tumores impide una cuantificación fiable de los vasos sanguíneos periféricos. Como resultado de las imágenes están teñidas por un agente de tinción sobre todo en los bordes, que está claramente presente en las películas 2 y 3. No pudimos evitar que el derrame, pero la información útil sobre los nódulos de cáncer, incluyendo su tamaño, forma y la presencia de vasos sanguíneos interior no se vio afectada. Claramente podría concluir que al menos para la circulación bronquial que se ha estudiado aquí, el suministro de sangre periférica participa en la perfusión del tumor, con algunos de perfusión presente también en el interior del tumor.

Materials

For image acquisition we have used a MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographic system produced by Xradia, Concord, USA.

Images were processed and analyzed using ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, France) and MicroView (General Electric, USA) software packages. Any available image analysis software can be used instead