Summary
Oförstörande volym visualisering kan endast uppnås genom tomografiska tekniker, av vilka de mest effektiva är x-ray mikro datortomografi (CT).
Abstract
Oförstörande volym visualisering kan endast uppnås genom tomografiska tekniker, av vilka de mest effektiva är x-ray mikro datortomografi (μCT).
Högupplöst μCT är en mycket mångsidig men exakt (1-2 mikrometer upplösning) teknik för 3D-undersökning av ex vivo biologiska prover 1, 2. I motsats till elektron tomografi, tillåter μCT granskning av upp till 4 cm tjocka prover. Denna teknik kräver bara några timmars mätning jämfört med veckor i histologi. Dessutom förlitar sig μCT inte på 2D stereologic modeller, vilket kan komplettera och i vissa fall kan även ersätta histologiska metoder 3, 4, som är både tidskrävande och destruktiv. Exempel luftkonditionering och positionering i μCT är enkelt och kräver inte höga vakuum eller låga temperaturer, vilket kan påverka strukturen. Provet placeras och roteras 180 ° eller 360 ° mellan en microfocused röntgen källa och en detektor, som innehåller en scintillator och en noggrann CCD-kamera för varje vinkel en 2D-bild är tagen, och sedan hela volymen är rekonstrueras med hjälp av en av de olika tillgängliga algoritmer 5-7. 3D-upplösningen ökar med minskningen av rotationen steg. Det nuvarande video-protokollet visar de viktigaste stegen i förberedelse, immobilisering och positionering av provet följt av avbildning med hög upplösning.
Protocol
1. Provberedning
- När du har extraherat vävnad som ska undersökas, kan mineraliserade vävnader placeras i instrumentet och avbildat. För att bilden på musen lårbenet en bör följa följande steg:
- Ta bort obduktion ben från en C57/Bl6 embryo 18,5 dagar postceutus (E18.5).
- Täta den smala änden av en polystyren pipettspets (20-200 l) med epoxiharts eller annat lim och fylla spetsen med arbetsnamnet buffert (PBS eller annat).
- Montera tätt benet i spetsen och försegla den andra änden med parafilm ark.
- Placera pipettspetsen i en lämplig hållare och följer protokoll från kapitel 3. För att visualisera lårbenet från mus benet embryot, är instrumentet som 40 kV och 200 μA. För 8μ upplösning 1000 projektion bilder med 4x förstoring måste förvärvas.
- Icke-mineraliserad vävnad måste först fastställdes och färgas för att öka X-ray dämpning av vävnad av intresse genom att använda en av de många tillgängliga protokoll 8,9. För råttan lungorna och liknande prov, är utarbetandet protokoll:
- Orthotopical implantation av icke småcellig lungcancer (NSCLC) NCI-H460 på naken råtta lungor
- Lungcancer knölar börja detekterbara fyra veckor från implantation
- Offer råttan och omedelbart ingjuta den med koksaltlösning blandad med heparin
- Injicera den med en utspädd lösning av Microfil (Flowtech), (2 ml av sammansatt lösning, 3 ml lösningsmedel och 0,3 ml härdare) i vänster kammare att färga bronkial cirkulationen
- Utdrag lungorna och hjärtat av råtta
- Immobilisera provet (se kapitel 2 i protokollet) genom att passa väl in i en 50 ml plastflaska provrör
- Skapa en mättad etanol atmosfär av utsläppandet på botten av röret en trasa fuktad i etanol
- Limma eller skruva fast röret i en hållare av instrumentet
- Fortsätt med inställning av imaging parametrar (kapitel 3). För komplett avbildning av råttans lungor källan är inställd på 40KV och 100 μA. För att nå 16μ upplösning måste man skaffa 2500 projektion bilder på en förstoring på 0,5 x.
2. Exempel immobilisering
Med hög upplösning, är det viktigt att undvika eventuella förändringar i provet position under mätningen. För detta är urvalet ordentligt fast i en plast-mottagare som passar dess storlek. Polystyren pipettspetsar, plast Pasteur pipetter eller specialbyggda plasthållare används i detta avseende. Enligt den experimentella krav, kan provet undersökas i luft eller nedsänkta i etanol eller buffertlösningar. Typiska immobilisering och slutlig placering av benet på musen embryot i instrumentet visas i figur 1.
Figur 1. Slutlig placering av embryonala musen benet i mikro CT instrumentet.
3. Inställning av förvärvet parametrar: x-ray spänning och ström, CCD exponeringstid
- Placeras i en hållare, skall provet tas i rotationen skede av instrumentet
- En första röntgenbild tas med den spänning och ström som godtyckligt.
- Om bilden är för mörk, bör man öka antalet fotoner först, så öka lite strömmen. Om detta inte är tillräckligt, bör man öka något energin i x-ray fotoner, dvs spänningen på röntgenröret.
- Om bilden är för ljust, bör man minska först spänningen, då den nuvarande.
- Ljusstyrkan i bilden kan ökas genom binning. Binning av 1 tar hänsyn till intensiteten för varje pixel i bilden, medan binning av 2 tar summan av varje matris av 2x2 pixlar. Bilden kommer vara ca 4 gånger starkare än i fallet med binning 1, men kommer att ha halv resolutionen.
- Efter inställning av optimal ljusstyrka måste man optimera exponeringstid på kameran till kompromiss mellan bästa kontrasten på ena sidan och en rimlig tid av experimentet på en annan sida.
- Kontrasten av bilder, särskilt av den låga absorbera prover, kan förbättras med hjälp av filter, som minskar fotonen flux, främst den i lägre energi fotonerna.
4. Exempel på placering
- Välj arbetar förstoring. Möjliga val är 0,5 x, 4x, 10x, 20x och 40x. Synfältet minskar med ökande förstoring.
- Få optimal upplösning och synfält genom att avstånden mellan röntgen källa och provet och mellan provet och detektorn. Ökad källan till provet avståndet minskar synfältet och ökar upplösningen. Prova att detektorn distans har motsatt effekt.
Hela fält som ska visas i 3D bör finnas iprojektion bild vid alla vinklar. Man bör kontrollera detta genom att vrida på prov i olika vinklar och genom att provet så nära som möjligt till rotationsaxeln. För detta bör man följa följande steg:
- Ta en bild vid 0 grader och sedan roterar provet vid -20 grader. Om den önskade volymen har förskjutits i sidled, bör man korrigera sin position genom att flytta rotationen axeln.
- Efter korrektion är det prov som skall roteras på en annan vinkel och position korrigeras igen, tills fältet av intresse är inne i bilden i alla vinklar från -90 till 90 grader.
5. Högupplöst tomogram
- Under mätningen skall provet rotera med en liten vinkel i taget och vid varje vinkel en projektion bilden tas. Det totala antalet bilder är alltid en kompromiss mellan önskad upplösning på ena sidan och tiden för mätning och filstorleken på en annan sida. Som framgår av Figur 2, innehåller varenda projektion alla skivor i provet anbringade ovanpå varandra och en framför en annan, och kan därför inte avslöja 3D-strukturen av provet.
Figur 2. Projektion bilder av lungorna hos råtta vid 0 ° (A), 45 ° (B) och 90 ° (C) vridningsvinkel.
- Först efter att ha tagit projektion bilder minst mellan -90 och 90 grader, kan man gå vidare till återuppbyggnaden av provvolymen. Rekonstruktion tar mellan 10 minuter och 2 timmar, beroende på den använda programvaran och av antalet projektioner. Återigen är den slutliga kvaliteten på 3D-bilden en kompromiss mellan önskad upplösning och den tid man vill spendera och storleken på den resulterande filen.
6. Bild skala kalibrering
Den pixel nivå (värde) i en rekonstruerad bild är unik för den bilden. För att kunna jämföra två olika bilder, har en unik intensitet skala som skulle åläggas varje bild. För detta
- Kör en tomography med en standard fantom med samma experimentella villkor som för provet
- Kalibrera provet bilden med de värden som erhålls för fantom. Den vanligaste skalan är Hounsfield (eller CT) skala. För 4x förstoring bakgrunden värdet av 15.000 (för vatten eller PBS) har ersatts med 0 och det högsta värdet på 35.000 för benet ersattes med standarden Hounsfield värde 3000. Andra pixelvärden resultat av linjär interpolation eller extrapolation baserat på dessa gränser.
7. Bildbehandling och analys
Efter att ha fått högupplösta bilder, måste man extrahera relevant information med hjälp av programvara bildanalys. Programpaketet som ska användas måste vara utformad för att fungera med mycket stora filer (upp till 20GB).
8. Representativa resultat
En representation av ett lårben från en C57/Bl6 musen på embryonala dag 18,5 (E18.5) - fyra dagar efter inledandet av mineraliseringen processen visas i figur 3. Mineralet lagren syns tydligt (vit), medan mjuka vävnader syns inte i denna beredning. Vi tog 1000 projektion bilder med en linjär förstoring på 4x. Den slutliga upplösningen är 8 mikrometer. En noggrann analys av den volym som gör visas i figur 1, visar att benet volymfraktion (den del av benet volym som är ockuperat av mineraliserad vävnad) är 0,18, och bentäthet är 723 mg / cm 3. Dessa värden ger oss möjlighet att jämföra denna struktur med ben i andra stadier av utveckling.
Figur 3. Olika representationer av en 3D-bild av en mus lårben embryo. Den tvärgående (tvärsnitt) (A), är sagital (medio-laterala) avsnitt (B) och en ögonblicksbild av volymen rendering (C) visas.
Figur 4 visar en 3D-bild av lungorna en kvinnlig naken råtta (RNU), 12 veckor gammal, implanteras orthotopically med icke småcellig lungcancer (NSCLC) NCI-H460. 2500 projektion bilder är tagna med en linjär förstoring 0,5 x, vilket garanterar en slutlig lösning av 16 mikrometer. Bilden visar Microfil färgade blodkärl (ner till 20 micron diameter). Bilden Analysen visar att 4 veckor efter implantation, finns flera cancer knutor bildas. De täcker en större del av lungvolym (17%). De flesta av pulmonell färgning hittades i perifera områden av tumörer. Betecknande som visas i figur 4B, flera blodkärl finns också inne i knutor, som omfattar enligt preliminära analyser cirka 3% av sin volym.
Figur 4. 3D-bild av cancer knutor växer i en råttalunga. En ögonblicksbild av volymen rendering (A) och ett snitt genom volymen (B) visas. Den cancer knölar är markerade med pilar.
Film 1. Volume rendering av musen lårbenet i figur 1. Klicka här för att se filmen.
Film 2. Volume rendering av råttan lungorna i figur 2. Klicka här för att se filmen.
Film 3. Serial sektioner genom lungorna. Den noduli visas som gråzoner i de flesta skivor. Klicka här för att se filmen.
Discussion
C57/Bl6 musen embryonala dag 18,5 (E18.5) är fyra dagar efter inledandet av mineraliseringen processen. I detta skede av utvecklingen, framtiden ben består av många lager av mineraliserat osteoids, tydligt ses i figur 3. På denna punkt bör man betona att mineraliserade vävnader kan visualiseras i lägre upplösning med olika instrument som kräver mindre provhantering. Det nuvarande protokollet (och mikro CT-instrument som används i den) förutom att ge högre upplösning, erbjuder högsta flexibilitet för användaren att välja den bästa geometriska parametrar för mätning.
Resultaten i figur 4 visar att i orthotopic djuret lungcancer modeller, kan mänskliga icke småcellig lungcancer framkalla rekrytering av blodkärl och kärlnybildning. Vi anser att lungorna inte var rörd, inte heller har dess form ändras under mätningen. Användaren bör vidta särskilda försiktighetsåtgärder för att undvika sådana förändringar under en tomografi. För vissa prover, speciellt för mjukare vävnad, måste man bygga speciella Fasthållningsdon att immobilisera perfekt provet under mätningen. Tyvärr förekomst av höga läckage av kontrastmedel i omgivningen av tumörer hindrade tillförlitlig kvantifiering av de perifera blodkärlen. Som ett resultat av de bilder som är behäftade med viss färgning agent, särskilt i kanterna, vilket är tydligt närvarande i filmer 2 och 3. Vi kunde inte förhindra att detta spiller, men användbar information om cancer knutor, inklusive deras storlek, form och förekomsten av inre blodkärl påverkades inte. Vi kan fastslå att åtminstone för bronkial cirkulation som studeras här, deltar perifert blod utbudet i tumören perfusion, presentera några perfusion även inne i tumören.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Studierna genomfördes vid Irving och Cherna Moskowitz Centrum för Nano och Bio-Nano Imaging vid Weizmann Institute of Science.
Vi är tacksamma för att Orna Yeger för hennes hjälp att utforma och driva detta protokoll.
Materials
| For image acquisition we have used a MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographic system produced by Xradia, Concord, USA. | |||
| Images were processed and analyzed using ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, France) and MicroView (General Electric, USA) software packages. Any available image analysis software can be used instead |
References
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50, 2-13 (2010).
- Bauer, J. S., Link, T. M.
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).
- Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. an Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23, 59-66 (1998).
- Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods. IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).
- Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT. Med Phys. 27, 754-772 (2000).
- Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT. Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).
- Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med Phys. 31, 305-313 (2004).
- Plouraboué, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. X-ray high-resolution vascular network imaging. J Microsc. 215, 139-148 (2004).
