Een methode voor ovariële follikel Encapsulation en cultuur in een proteolytisch Afbreekbare 3 dimensionale systeem

Samenvatting

Een nieuwe methode voor ovariële follikel inkapseling in een 3D-fibrine-alginaat interpenetrerend netwerk wordt beschreven. Dit systeem combineert een structurele ondersteuning met proteolytische degradatie van de ontwikkeling van onvolgroeide follikels steun aan rijpe eicellen te produceren. Deze methode kan worden toegepast op de cultuur cel aggregaten tot cel-cel contacten, zonder beperking van de uitbreiding te behouden.

Samenvatting

De ovariële follikel is de functionele eenheid van de eierstok dat seks hormonen afscheidt en ondersteunt de eicel rijping. In vitro follikel technieken bieden een tool om model follikel ontwikkeling om de fundamentele biologie te onderzoeken, en worden verder ontwikkeld als een techniek om de vruchtbaarheid te behouden in de kliniek ^1-4. Onze in-vitro-cultuur systeem maakt gebruik van hydrogels in om de inheemse ovariële omgeving na te bootsen door het handhaven van de 3D-folliculaire architectuur, cel-cel interacties en paracriene signalen dat de directe follikelontwikkeling ^5. Voorheen werden follikels met succes gekweekt in alginaat, een inert algen-afgeleide polysaccharide die gelering ondergaat met calcium-ionen ^6-8. Alginaat hydrogelen gevormd bij een concentratie van 0,25% w / v waren de meest tolerante voor follikel cultuur, en behield de hoogste ontwikkelingscompetentie ^9. Alginaat hydrogels zijn niet afbreekbaar zijn, dus een toename van het follikel diameter resulteert in een drukkracht op de follikel dat de follikelgroei ¹⁰ van invloed kan zijn. We vervolgens ontwikkelden een cultuur gebaseerd op een fibrine-alginaat interpenetrerend netwerk (FA-IPN), waarin een mengsel van fibrine en alginaat tegelijkertijd worden gegeleerd. Deze combinatie zorgt voor een dynamische mechanische omgeving, omdat beide componenten bijdragen aan de stijfheid matrix in eerste instantie, maar proteasen afgescheiden door de groeiende follikel degraderen fibrine in de matrix waardoor alleen alginaat om ondersteuning te bieden. Met het IPN, kan de alginaat inhoud moet lager dan 0,25%, wat niet mogelijk is met alginaat alleen ^5. Dus, als de follikel groeit, zal het ervaren een verminderde drukkracht ten gevolge van de verminderde gehalte aan vaste stoffen. Hierin beschrijven we een inkapseling methode en een in-vitro-cultuur systeem voor follikels in de eierstokken binnen een FA-IPN. De dynamische mechanische omgeving bootst de natuurlijke ovariële klimaat waarin kleine follikels wonen in een rigide cortex en verhuizen naar een meer tolerante medulla als ze in omvang toenemen ^11. De afbreekbare component kan worden bijzonder kritisch voor de klinische vertaling, om de meer dan 10 ^6-voudige toename in het volume dat de menselijke follikels normaal ondergaan in vivo te ondersteunen.

Protocol

1. Follikel Isolatie

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren en de gevestigde institutionele Animal Gebruik en onderhoud protocol aan de Northwestern University.

Voor optimale resultaten, worden alle dissecties uitgevoerd in L15 media voor de pH-regeling bij een omgevingstemperatuur niveau van CO _2, op 37 ° C verhit podia voor de temperatuurregeling, en op een schone bank om bacteriële besmetting te minimaliseren. De dissectie media (DM) is bereid met ....

Discussie

De gepresenteerde ovariële follikel inkapseling methode in een FA-IPN maakt follikel cultuur in een 3D omgeving in vitro. Een FA-IPN is een dynamische, cel-responsieve matrix waarin de aanvankelijke mechanische eigenschappen worden bepaald door de combinatie van beide fibrine en alginaat. Tijdens de cultuur, de ingekapselde follikel activeert proteases dat slechts een onderdeel van het IPN, de fibrine, wat resulteert in een geleidelijk afnemende gel stijfheid die wordt bijgedragen uitsluitend door de resterende.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fetuïne	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotinine	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Tisseel Fibrine kit	Baxter Internationl Inc.	921030
Natriumalginaat	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa