Ein Protokoll, um Neuronen im Schnitt<em> C. elegans</em> Mit einem MicroPoint gepulster Laser vorgestellt. Wir beschreiben die Einrichtung des Systems, Immobilisierung Würmer und Durchtrennen markierten Neuronen. Vorteile sind ein relativ kostengünstiges System und die Fähigkeit, neuronale Prozesse oder abzutragen Zellen trennen<em> In vivo</em>.
Neuronen mit anderen Zellen über Axone und Dendriten, schlank Membran-Erweiterungen, die prä-oder post-synaptischen Spezialisierungen enthalten kommunizieren. Wenn ein Neuron durch Verletzung oder Krankheit beschädigt wird, kann es zu regenerieren. Cell-inneren und äußeren Faktoren beeinflussen die Fähigkeit eines Neurons zu regenerieren und Restore-Funktion. Vor kurzem hat die Nematoden C. elegans wurde als ein hervorragendes Modell Organismus entstanden, um Gene zu identifizieren und Signalwege, die die Regeneration von Neuronen 1-6 beeinflussen. Die wichtigste Methode, um neuronale Regeneration in C. initiieren elegans ist die Laser-vermittelte Schneiden oder Axotomie. Während Axotomie, ist ein fluoreszenzmarkierten neuronalen Prozess abgetrennt mit Hochenergie-Impulsen. Zunächst neuronalen Regeneration in C. elegans wurde unter Verwendung eines verstärkten Femtosekunden-Laser 5. Allerdings haben anschließenden Regeneration Studien gezeigt, dass eine konventionelle gepulste Laser verwendet werden, um genau zu trennen Neuronen in vivo und rufen eine ähnliche regenerative Antwort 1,3,7 werden.
Wir präsentieren ein Protokoll für die Durchführung von In-vivo-Laser Axotomie in der Wurm mit Hilfe eines MicroPoint gepulsten Lasers, ein schlüsselfertiges System, das leicht zugänglich ist und dass wurde in großem Umfang für gezielte Zellablation verwendet. Wir beschreiben die Ausrichtung der Laser-, Montage der Würmer, Schneiden bestimmten Neuronen und Beurteilung anschließende Regeneration. Das System bietet die Möglichkeit, eine große Zahl von Neuronen in mehreren Würmern während eines Experiments abgeschnitten. So ist die Laser-Axotomie wie hier beschrieben, ein effizientes System für die Initiierung und Analyse des Prozesses der Regeneration.
Eine Vielzahl von Lasersystemen wurden verwendet, um Neuriten in C schneiden elegans, und mehrere Studien haben ihre Leistung im Detail 3,7,10,11 untersucht. Die MicroPoint Laser in unserem Protokoll ist ein schlüsselfertiges System, das einfach zu installieren und zu warten ist, und wird zu einem niedrigen Preis den Forschern im Vergleich zu einem Ti-Saphir-Laser-System zur Verfügung. Im Vergleich zu einem Ti-Saphir-System, jedoch ist die MicroPoint Laser erwartet, dass Schäden an einer größeren Fläche, die nachteilig für einige Anwendungen führen kann. Wenn ein Ti-Saphir-System gewünscht wird, ist ein hervorragendes Protokoll auf den Aufbau eines solchen Systems zur Verfügung 12.
Das aktuelle Protokoll kann auf einer Vielzahl von Neuronen in C durchgeführt werden elegans, aber stellen wir fest, dass die Unterschiede in der regenerativen Fähigkeiten zwischen verschiedenen Typen von Neuronen 13 sind zu erwarten. Darüber hinaus können verschiedene transgene Hintergründe beeinflussen regenerative Erfolg. Obwohl der Prozentsatz der Regeneration GABA Neuronen ist ziemlich konstant zwischen verschiedenen transgenen Marker Stämme haben wir festgestellt, insgesamt einen leichten Anstieg der Regeneration in juIs76 14 vs oxIs12 15 Würmer. Die Unterschiede zwischen den Markierungen des Touch-Neuronen wurden auch 2 beschrieben.
Wir bevorzugen es, die Würmer mit Mikroperlen als Anästhetika immobilisieren wie die Perlen in schneller und konsequenter Ruhigstellung 16 Resultat. Dies ist auch vorteilhaft, da wir in der Lage, um die Regeneration frei von möglichen Verwechslung Effekte durch Anästhesie 17 zu beobachten sind. Eine Alternative Anästhesie-freie Methode zur Immobilisierung ist die Verwendung von mikrofluidischen Bauteilen. Der Einsatz der Mikrofluidik für Axotomie wurde ausgiebig 17-22 beschrieben.
Wir finden, dass mit konsequenten Einsatz der Laser funktioniert am besten, wenn das Cumarin in den Farbstoff-Zelle 440 geändert wird einmal pro Woche nach dem Eingriff in die MicroPoint Handbuch beschrieben ist. Falls erforderlich, kann die Dämpfung Schieberegler verwendet, um Macht zu erhöhen, aber dies kann ein Hinweis auf alte Farbstoff-oder Laser-Versatz werden. Außerdem hat der Farbstoff-Zelle eine begrenzte Lebensdauer und muss in absehbarer Zeit umgebaut oder ersetzt werden (siehe Fehlersuche).
Es kann schwierig sein, das Ziel Neuriten unter dem Fadenkreuz, dass der Laserfokus markieren Manöver, vor allem wenn das Tier nicht vollständig gelähmt ist. Wir finden, dass eine manuelle Bühne nicht optimal ist für diesen Zweck, obwohl es sicherlich brauchbar ist. Ein Joystick-gesteuerte motorische Phase ist präziser, und wir finden, dass mit einer Software, Bild Ziehen mit der Maus, um den motorisierten Bühne bewegen unterstützt am besten ist. Nikon Elements bietet diese Funktion und wird in diesem Protokoll beschrieben, aber die freie Mikromanager Paket, sowie andere Imaging-Software, kann eine ähnliche Funktionalität haben. Eine andere Art von feinen Ausrichtung ist es, den Laserfokus zu verschieben, anstatt das Tier. Ein Galvanometer beam-Lenkung ist als Add-on auf die MicroPoint Laser, wenn dieser Ansatz wird bevorzugt.
Neben ihrer Anwendung auf die Untersuchung der neuronalen Regeneration, kann der Laser benutzt, um andere Zelltypen, wie Haut-, Muskel-oder spezialisierte Zellen abzutragen oder zu stören spezifischen neuronalen Synapsen 23-27 sein. Darüber hinaus könnte Signalwege, die zur Degeneration von Nervenzellen, die Verletzung oder Krankheit begleitet regeln mit diesem System untersucht werden. Als solche wird die Verwendung von gepulsten Lasern weiter leuchten sowohl die genetischen Faktoren und die zellbiologische Veränderungen, die neuronale Regeneration und anderen relevanten Prozesse zu erleichtern vergossen.
Fehlerbehebung:
Hier beschrieben werden einige häufig auftretende Probleme und ihre Lösungen beschrieben.
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit in den Hammarlund Labor wird gefördert durch: NIH gewährt R01 NS066082-01 und T32GM007223, die Beckman-Stiftung, und der Ellison Medical Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
0.05 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 08691 | |
0.10 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 00876 | |
Agarose GPG/LE | American Bioanalytical | 00972 | Ultra pure |
Falcon 14 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352057 | 17 x 100 mm style, nonpyrogenic |
Thermo Scientific Plain precleaned microscope slides | Erie Scientific Company | 420-004T | 3″ x 1″ x 1 mm |
Cover Slips | VWR | 48366 205 | 18 mm x 18 mm No. 1 1/2 |
KIMTECH Science Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
BD Falcon 100 x 15mm Style Petri Dish | BD Biosciences | 351029 | |
Tape blank 3/4w x 500L | TimeMed | T-512 | |
Immersion oil | Nikon | Type A, nd=1.515 | |
EG1285 or CZ1200 | C. elegans Genetic Center | http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ | |
OptiScan II | PRIOR Scientific | ||
NIS-Elements Ar or Br | Nikon | ||
MicroPoint Ablation Laser System | Photonic Scientific | ||
Compound microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Hamamatsu Camera | Hamamatsu Photonics | Model C8484-05G01 | |
Dell Precision T3400 PC with Intel Core 2 Duo | Dell | ||
Windows XP Professional | Microsoft | Version 2002, Series Pack 3 | |
Dual dry bath Incubator | Fisher Scientific | Analog controls | |
4X Plan Fluor objective | Nikon | ||
100X Plan Apo VC oil objective | Nikon | ||
Dumont #5/45 forceps | Dumont | 11251-35 | Dumoxel standard tips, can also use #7 |
Dissecting Microscope | Nikon | SMZ800 | With NI-150 High Intensity Illuminator |