Ett protokoll för att skära nervceller i<em> C. elegans</em> Med en MicroPoint pulsad laser presenteras. Vi beskriver införandet av systemet, immobilisera maskar och skära märkta nervceller. Fördelar är en relativt låg kostnad systemet och möjligheten att avskilja neuronala processer eller ablate celler<em> In vivo</em>.
Nervceller kommunicerar med andra celler via axoner och dendriter, smal membran tillägg som innehåller före eller postsynaptiska inriktningar. Om en neuron är skadade av skada eller sjukdom, kan det återhämta sig. Cell-endogena och exogena faktorer påverkar möjligheten för en neuron för att förnya och återställa funktion. Nyligen, rundmasken C. elegans har trätt fram som en utmärkt modell organism för att identifiera gener och signalvägar som påverkar förnyelse av nervceller 1-6. Det huvudsakliga sättet att inleda neuronal regeneration i C. elegans är laser-medierad skär eller axotomy. Under axotomy är ett fluorescerande-märkt neuronala processen avhuggna med hög energi pulser. Inledningsvis neuronal regeneration i C. elegans undersöktes med hjälp av en förstärkt femtosecond laser 5. Dock har senare förnyelse studier visat att en konventionell pulsad laser kan användas för att noggrant skära nervceller in vivo och framkalla en liknande regenerativ svar 1,3,7.
Vi presenterar ett protokoll för att utföra in vivo laser axotomy i masken med hjälp av en MicroPoint pulsad laser, ett nyckelfärdigt system som är lätt tillgängliga och som har använts i stor omfattning för riktade cell ablation. Vi beskriver rikta lasern, montering av maskar, kapning specifika nervceller, och bedöma efterföljande föryngring. Systemet ger möjlighet att skära ett stort antal nervceller i flera maskar under ett experiment. Således är laser axotomy som beskrivs häri ett effektivt system för att initiera och analysera processen för förnyelse.
En mängd olika lasersystem har använts för att skära neurites i C. elegans, och flera studier har undersökt sina resultat i detalj 3,7,10,11. Den MicroPoint laser som används i våra protokoll är ett nyckelfärdigt system som är enkelt att installera och underhålla, och är tillgänglig till en låg kostnad för forskare jämfört med en Ti-Safir lasersystem. Jämfört med en Ti-Safir system är dock MicroPoint laser förväntas orsaka skador på en större yta, vilket kan vara till nackdel för vissa tillämpningar. Om en Ti-Safir-system är önskvärt, är ett utmärkt protokoll på att bygga ett sådant system finns 12.
Den nuvarande protokollet kan utföras på en mängd olika nervceller i C. elegans, men noterar vi att skillnader i regenerativ förmåga mellan olika typer av nervceller väntas 13. Dessutom kan olika transgena bakgrunder påverkar regenerativ framgång. Även andelen regenererande GABA nervceller är ganska konsekvent mellan olika transgena markör stammar har vi noterat en total viss ökning av förnyelse i juIs76 14 vs oxIs12 15 maskar. Skillnader mellan markörer vid beröring nervceller har också beskrivits 2.
Vi föredrar att immobilisera maskar med mikrokulor snarare än bedövningsmedel som pärlor resultera i snabbare och mer konsekvent immobilisering 16. Detta är också en fördel som vi kan iaktta förnyelse utan eventuella confounding effekter till följd av anestesi 17. Ett alternativ anestesi-fri metod för fixering är att använda mikroflödessystem enheter. Användningen av mikrofluidik för axotomy har i stor utsträckning beskrivits 17-22.
Vi finner att med konsekvent använda, är lasern fungerar bäst när Kumarin 440 i färgen cellen byts en gång varje vecka enligt det förfarande som beskrivs i MicroPoint manualen. Vid behov kan dämpningen reglaget användas för att öka makten, men detta kan vara ett tecken på gammal färg eller laser förskjutning. Dessutom har färgen cellen en begränsad livslängd och kommer så småningom att behöva byggas om eller bytas ut (se Felsökning).
Det kan vara svårt att manövrera målet neurite under hårkorset som markerar laser fokus, särskilt om djuret ofullständigt är förlamad. Vi finner att en manuell skede inte är optimalt för detta ändamål, men det är verkligen användbar. En joystick-styrd motoriserade stadiet är mer exakt, och vi anser att användning programvara som stöder bilden att dra med musen för att flytta motoriserade scenen är bäst. Nikon Elements ger denna funktion och beskrivs i detta protokoll, men den fria Micromanager paketet, liksom andra bildhanteringsprogram, kan ha liknande funktionalitet. Ett annat sätt av fina inriktning är att flytta lasern fokus, snarare än djuret. En galvanometer balk-styrmekanism finns som ett tillägg till MicroPoint laser, om detta tillvägagångssätt är att föredra.
Förutom sin ansökan till att studera neuronal regeneration, kan lasern användas för att avlägsna andra celltyper, såsom hud, muskler eller specialiserade celler, eller för att störa specifika neuronala synapser 23-27. Dessutom kan vägar som reglerar degeneration av nervceller som medföljer skada eller sjukdom undersökas med detta system. Som sådan kommer att använda pulsad laser fortsätta att belysa både genetiska faktorer och cellbiologiska förändringar som underlättar neuronal regeneration och andra relevanta processer.
Felsökning:
Som beskrivs här är några vanliga problem och tillhörande lösningar.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i Hammarlund labbet är finansierat av: NIH bidrag R01 NS066082-01 och T32GM007223, Beckman Foundation och Ellison Medical Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
0.05 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 08691 | |
0.10 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 00876 | |
Agarose GPG/LE | American Bioanalytical | 00972 | Ultra pure |
Falcon 14 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352057 | 17 x 100 mm style, nonpyrogenic |
Thermo Scientific Plain precleaned microscope slides | Erie Scientific Company | 420-004T | 3″ x 1″ x 1 mm |
Cover Slips | VWR | 48366 205 | 18 mm x 18 mm No. 1 1/2 |
KIMTECH Science Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
BD Falcon 100 x 15mm Style Petri Dish | BD Biosciences | 351029 | |
Tape blank 3/4w x 500L | TimeMed | T-512 | |
Immersion oil | Nikon | Type A, nd=1.515 | |
EG1285 or CZ1200 | C. elegans Genetic Center | http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ | |
OptiScan II | PRIOR Scientific | ||
NIS-Elements Ar or Br | Nikon | ||
MicroPoint Ablation Laser System | Photonic Scientific | ||
Compound microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Hamamatsu Camera | Hamamatsu Photonics | Model C8484-05G01 | |
Dell Precision T3400 PC with Intel Core 2 Duo | Dell | ||
Windows XP Professional | Microsoft | Version 2002, Series Pack 3 | |
Dual dry bath Incubator | Fisher Scientific | Analog controls | |
4X Plan Fluor objective | Nikon | ||
100X Plan Apo VC oil objective | Nikon | ||
Dumont #5/45 forceps | Dumont | 11251-35 | Dumoxel standard tips, can also use #7 |
Dissecting Microscope | Nikon | SMZ800 | With NI-150 High Intensity Illuminator |