Summary
В тритон, объектив всегда восстанавливает из спинной диафрагмы по трансдифференцировки радужной оболочки пигментированных эпителиальных клеток (ИПЭС). Здесь мы опишем процедуру культуры спинной и брюшной тритон IPE клеток и их имплантации в глаз тритона. Имплантированные клетки затем изучали срезов тканей и иммуногистохимии.
Abstract
Саламандры, как тритонов и аксолотля обладают способностью к регенерации многие из утраченных частей тела, таких как конечности, хвост с спинного мозга, глаз, мозга, сердца, челюсти 1. В частности, тритоны являются уникальными для его способность регенерации линзы. После удаления хрусталика, IPE клетки спинного диафрагмы transdifferentiate в объектив клетки и в конечном итоге образуют новый объектив примерно через месяц 2,3. Это свойство регенерации никогда не выставлялись на вентральной клетки радужной оболочки. Регенерации потенциал клетки диафрагмы могут быть изучены путем трансплантации в пробирке культурный IPE клеток. Для культуры, спинной и брюшной диафрагмы клетки впервые выделен из глаз и культурный отдельно по времени в течение 2 недель (рис. 1). Эти культивируемые клетки являются reaggregated и имплантировали обратно тритона глаз. Прошлые исследования показали, что спинной reaggregate сохраняет свои линзы формирования мощности в то время как совокупный вентральной не образует линзы, сводный, таким образом, в процессе естественных условиях (рис. 2) 4,5. Эта система определения регенерации потенциал спинной и брюшной клетках диафрагмы очень полезна при изучении роли генов и белков, участвующих в регенерации линзы.
Protocol
1. Ирис культуре клеток
- Сбор глазных яблок с 7 тритоны (под наркозом в 0,1% этил-3-аминобензоат метансульфоновая кислоты, полученной в PBS) и поместить в свободный кальций магний Хэнкс решение (CMF).
- Изменение перчатки и работать в капот культуры ткани.
- Стерилизовать глазные яблоки в Lugol's-этанола в течение 3 секунд.
- Мыть 2 раза в CMF.
- Передача глаза Хэнкс и начать вскрытие.
- Рассеките радужной оболочки роговицы сложных и удалить нейронных сетчатки.
- Передача комплексов в новое блюдо из Хэнкс.
- Использование № 15 скальпеля, отдельных комплексов в спинной и брюшной части.
- Удалите диафрагму фрагментов (вентральной первый) и поместить в посуду, содержащую 1 мл L-15.
- Добавить 15% (150 мкл) объема dispase (7,5 ед / мл концентрации).
- Инкубировать при 27 ° С в течение 2 часов (обернуть блюдо с парафильмом).
- Изолировать IPE клетки стромы (Место раствора трипсина при 27 ° С).
- Сбор IPE клеток в 1,5 мл трубки.
- Центрифуга при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре (комнатной температуры) в течение 2 минут, удалите супернатант.
- Промыть 1 мл Хэнкс и центрифуге при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 2 минут, удалите супернатант.
- Добавьте 1 мл раствора трипсина, инкубировать в течение 2 часов при 27 ° C.
- Центрифуга при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 2 минут, удалите трипсина.
- Добавить 1 мл L-15 мыться, центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 2 минут.
- Добавить 800 ул L-15, пипетка медленно вверх и вниз, ~ 10 раз (более чем в 12 раз снижает приверженность лечению).
- Пластина IPE клеток на 24 и коллагена покрытием пластины и инкубировать при 27 ° С в течение 2 недель (как правило, 4 спинных и 4 вентральной скважин получены от 7 тритоны).
- На данном этапе клетки пригодны для трансфекции генов или лечение факторов, чтобы определить их роль в стимулировании или препятствий регенерации линзы.
2. Агрегация клеток Iris
- Для чашки, содержащие клетки диафрагмы добавить 20 мкл dispase решение до 400 мкл среды, вихрем мягко.
- Инкубируйте пластин при 27 ° С в течение ночи.
- Внесите мягко вверх и вниз, чтобы сместить клетки
- Место клеток в Эппендорф трубки и спина в течение 2 минут при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре.
- Удаление средних и мыть добавлением 1 мл полной L-15, спина 2 минут при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре, удалите среды.
- Используйте 2000-7000 клеток в совокупности. Добавить 200 мкл L-15 в совокупности в каждую пробирку.
- Разбить ячейки (200 мкл) в новые трубы Эппендорф.
- Спиновые при 1000 оборотов в минуту в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Инкубируйте в течение 48 часов при 27 ° C.
3. Имплантация Aggregrated Клетки
- Сделайте разрез в роговице глаза тритона и снять линзы.
- После удаления хрусталика, место IPE агрегатную ячейку чуть ниже роговицы на брюшной стороне глаза.
- Тритоны хранятся в течение месяца, чтобы позволить им регенерации линзы.
4. Вложение Ньют глаз
- Удалить тритон глаза имплантировали совокупности и поместить его в фосфатным буферным раствором (PBS).
- Зафиксируем в 4% параформальдегида при 4 ° С в течение по крайней мере 4 часа или на ночь.
- Стирать в PBS, 4 ° С в течение 30 минут.
- Относитесь к нему с 0,85% физиологического раствора: 4 ° C, 30 минут.
- Стирать в Соленые / этанол (1:1): RT в течение 15 минут.
- Стирать в 70% этанола: РТ, 15 минут. Повторяйте это раз.
- Стирать в 85% этанола и 95% этанола при комнатной температуре 30 минут каждый
- Стирать в 100% этанола: РТ, 30 минут. Повторяйте это раз.
- Хранить при температуре 4 ° С или продолжить.
- Стирать в 100% ксилола: РТ, 30 минут. Повторяйте это раз.
- Лечить ксилолом / парафина (1:1): 60 ° C, 45 минут.
- Лечить со 100% парафина: 60 ° C, 20 минут. Повторите это еще два раза.
- Добавить в вложение пресс-форм.
5. Секционирование
- Подготовка 15 мкм участков глаза, используя встроенный микротоме.
- Место глаз разделы по желатин покрытием слайд-шоу и оставить его на слайд теплее.
6. Окрашивание
- Место слайды в ксилоле в течение 10 минут. Повторите это еще раз.
- Гидратов в: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% этанола в течение 1 минуты каждый
- Промойте в воде DI ни на минуту.
- Стирать в PBS в течение 15 минут.
- Стирать в PBST (0,2% Triton-X 100 в PBS) в течение 15 минут.
- Стирать в PBS в течение 15 минут.
- Место в блокировании решения (10% козьего вторичные антитела) в течение часа.
- Место в первичных антител для ночлега.
- Вымойте первичных антител в PBS в течение 15 минут.
- Стирать в PBST в течение 15 минут.
- Стирать в PBS в течение 15 минут.
- Место в вторичными антителами в течение 2 часов в темном (1:100 разведения в PBS).
- Стирать в PBS, PBST и PBS в течение 15 минут, а затем установите.
- Соблюдайте слайдов под флуоресцентным микроскопом.
7. Представитель Результаты:
Эта процедура культивирования тритон лэто клетки были использованы для изучения регенерации потенциал спинной и брюшной IPE клеток. Более того, это также возможно для изучения конкретных генов, которые способствуют механизм регенерации линзы в глаз тритона. Когда клетки культивировали в течение 2 недель (рис. 1) они могут быть трансфицированных генами, чтобы изучить их роль в регенерации линзы. Особый интерес представляют гены, которые могут вызвать вентральной диафрагмы. С вентральной клетки диафрагма не может transdifferentiate на линзы (рис. 2) индуктивной функции генов-кандидатов могут быть изучены. В прошлом, с помощью этой техники мы показали, что, когда шесть-3 была более выраженной в присутствии ретиноевой индукции линзы кислоты наблюдается с брюшной диафрагмы 6. На рисунке 3 мы видим, что совокупные вентральной диафрагмы породил взрослого и дифференцированные объектив (стрелки), не отличается от хоста объектив от спинной диафрагмы (стрелка).
Рисунок 1. а) Спинная диафрагма пигментированные эпителиальные клетки культивировали в пробирке в течение 2 недель. б) брюшной диафрагмы пигментированные эпителиальные клетки культивировали в пробирке в течение 2 недель. Обратите внимание, что пигментация сохраняется до этой стадии в обоих спинной и брюшной клетки радужной оболочки.
Рисунок 2. Регенерация способность культурный IPE клеток. ) Объектив индукции из спинной IPE совокупности клетки (стрелки). Хост индукции линз из спинной диафрагмы (стрелка), ди: спинной диафрагмы, В. И.: вентральной ирис, ле: объектив эпителия, Л. Ф.: объектив волокон. б) отсутствие индукции линз из вентральной IPE совокупности клетки (стрелки). Хост индукции линз из спинной диафрагмы (стрелка).
Рисунок 3. Объективы индукции из вентральной совокупности трансфекции с шестью-3 и обрабатывают ретиноевой кислоты. Хост индукции линз из спинной диафрагмы (стрелка). Объективы индукции из вентральной агрегат (стрелки).
Discussion
Этот протокол установил в пробирке системы для изучения механизмов регенерации линзы у тритонов. Так как агрегаты (либо со спины или вентральной преданно следовать за их поведением в естественных условиях в процессе регенерации эта техника может облегчить огромные усилия, необходимые для трансгенез у тритонов и может быть использовано для усиления функции, а также потеря функции экспериментов 7,8,9. Кроме того, , агрегатов или ирисы в целом может легко относиться с факторами роста и изучать их влияние, как описано в данном протоколе. Например роль BMP пути изучалась с помощью этой техники 6.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NIH грант Ey10540 к PAT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
- Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. Eye regeneration at the molecular age. Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).
- Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster. Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).
- Hayashi, T. Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration. Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).
- Grogg, M. W. BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration. Nature. 438, 858-862 (2005).
- Nakamura, K. miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking. PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).
- Madhavan, M. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).
- Maki, N. Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo. FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).
