Summary
في نيوت ، العدسة يجدد دائما من قزحية الظهرية التي transdifferentiation من الخلايا الظهارية الصباغية القزحية (IPES). نحن هنا وصف الإجراء إلى الخلايا الثقافة نيوت الظهرية والبطنية IPE وترسيخها على نيوت للعين. وبعد ذلك درس زرع الخلايا والأنسجة التي sectioning المناعية.
Abstract
السلمندر مثل نيوت وقنفذ البحر تمتلك القدرة على تجديد العديد من أجزاء جسمه مثل فقدان الاطراف ، والذيل مع النخاع الشوكي ، والعين والدماغ والقلب ، والفك 1. على وجه التحديد ، هي فريدة من نوعها لسمندل الماء لها القدرة على التجدد العدسة. بعد إزالة العدسة والخلايا IPE القزحية الظهرية transdifferentiate إلى خلايا العدسة وشكل في نهاية المطاف إلى عدسة جديدة في حوالي 2،3 شهر. أبدا عرض هذه الخاصية للتجديد من قبل خلايا قزحية البطني. ويمكن دراسة إمكانية تجديد خلايا القزحية من خلال جعل عمليات زرع للخلايا في المختبر IPE مثقف. للثقافة ، وعزله للمرة الأولى في ظهري وبطني خلايا قزحية العين من ومثقف على حدة لفترة زمنية من 2 أسابيع (الشكل 1). وهذه الخلايا reaggregated المثقف ومزروع الخلفي للعين نيوت. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن يحتفظ reaggregate الظهرية قدرتها تشكيل العدسة في حين أن إجمالي بطني لا تشكل العدسات ، وتلخص ، وبالتالي فإن العملية المجراة في (الشكل 2) 4،5. هذا النظام من تحديد إمكانية تجديد خلايا قزحية ظهري وبطني مفيد جدا في دراسة دور الجينات والبروتينات المشاركة في تجديد العدسة.
Protocol
1. قزحية خلية ثقافة
- جمع مقل العيون في الفترة من 7 سمندل الماء (0.1 ٪ في تخدير إيثيل 3 أمينوبنزوات الميثان السلفونيك حمض المعدة في برنامج تلفزيوني) ووضعه في المغنيسيوم الكالسيوم حل هانكس الحرة (CMF).
- تغيير القفازات والعمل في نسيج الثقافة هود.
- تعقيم كرات العين في Lugol's - EtOH لمدة 3 ثوان.
- غسل 2 مرات في CMF.
- نقل عينيه لهانكس ويبدأ تشريح.
- تشريح قزحية العين ، القرنية معقدة وإزالة الشبكية العصبية.
- نقل المجمعات في طبق جديد من هانكس.
- # 15 باستخدام مشرط ومجمعات منفصلة إلى نصفين ، أحدهما ظهري وبطني.
- إزالة شظايا القزحية (البطنية الأولى) ووضع في صحن يحتوي على 1 مل L - 15.
- إضافة 15 ٪ (150 UL) حجم dispase (7.5 وحدة / مل تركيز).
- احتضان حتى 27 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (التفاف الطبق مع parafilm).
- عزل الخلايا من IPE سدى (حل مكان التربسين حتى 27 درجة مئوية).
- جمع الخلايا IPE في أنبوب مل 1.5.
- الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة في RT (درجة حرارة الغرفة) لمدة 2 دقيقة ، وإزالة طاف.
- يغسل مع هانكس 1 مل والطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة على RT لمدة 2 دقيقة ، وإزالة طاف.
- إضافة 1 مل من محلول التربسين ؛ احتضان لمدة 2 ساعة على 27 درجة مئوية.
- الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة على RT لمدة 2 دقيقة ، وإزالة التربسين.
- إضافة 1 مل L - 15 ليغسل ، والطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
- إضافة UL 800 L - 15 ، الماصة ببطء وباستمرار ~ 10 مرات (أكثر من 12 مرة يقلل من الالتزام).
- لوحة الخلايا IPE على طبق من ذهب 24 الكولاجين ومغلفة جيدا احتضان حتى 27 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع (عادة ، 4 الظهرية ويتم الحصول على 4 آبار بطني من 7 سمندل الماء).
- في هذه المرحلة هي مناسبة لخلايا ترنسفكأيشن الجينات أو العلاج مع عوامل لتحديد دورها في تحريض أو التداخل مع التجدد العدسة.
2. تجميع خلايا إيريس
- لوحات تحتوي على خلايا قزحية إضافة 20μl حل dispase إلى 400 ميكرولتر المتوسطة ، دوامة بلطف.
- احتضان لوحات على 27 درجة مئوية ليلة وضحاها.
- الماصة بلطف صعودا ونزولا لإزاحة الخلايا
- خلايا مكان في أنبوب إيبندورف وتدور لمدة 2 دقيقة على 1000 دورة في الدقيقة في RT.
- إزالة المتوسطة وغسل بإضافة L - 15 1 مل كاملة ، وتدور 2 دقيقة في 1000 دورة في الدقيقة على RT ، وإزالة المتوسط.
- استخدام خلايا 2000-7000 في مجموع المباراتين. إضافة UL 200 L - 15 في التجميعية في كل أنبوب.
- انقسام الخلايا (200 ميكرولتر) في أنابيب إيبندورف جديدة.
- تدور في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة على RT.
- احتضان لمدة 48 ساعة على 27 درجة مئوية.
3. زرع خلايا Aggregrated
- جعل فتحة في القرنية من العين نيوت وإزالة العدسة.
- بعد إزالة العدسة ، ضع التجميعية الخلية IPE أقل بقليل من نسيج القرنية على الجانب البطني من العين.
- يتم الاحتفاظ سمندل الماء لمدة شهر للسماح لهم تجديد العدسة.
4. التضمين من العين نيوت
- إزالة العيون نيوت زرع الكلي مع وضعه في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- الإصلاح في بارافورمالدهيد 4 ٪ عند 4 درجات مئوية على الأقل 4 ساعات أو طوال الليل.
- يغسل في برنامج تلفزيوني ، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
- التعامل معه المالحة 0.85 ٪ : 4 درجة مئوية و 30 دقيقة.
- يغسل في المؤسسة العامة لتحلية / الإيثانول (1:1) : RT لمدة 15 دقيقة.
- يغسل في الايثانول 70 ٪ : RT و 15 دقيقة. كرر ذلك مرة واحدة.
- يغسل في الايثانول 85 ٪ و 95 ٪ في الإيثانول RT ، 30 دقيقة كل
- يغسل في الإيثانول بنسبة 100 ٪ : RT و 30 دقيقة. كرر ذلك مرة واحدة.
- المحل في 4 درجات مئوية أو متابعة.
- يغسل في الزيلين 100 ٪ : RT ، 30 دقيقة. كرر ذلك مرة واحدة.
- علاج مع الزيلين / البارافين (1:1) : 60 درجة مئوية و 45 دقيقة.
- علاج برافين مع 100 ٪ : 60 درجة مئوية و 20 دقيقة. تكراره مرتين أخريين.
- تضمين في تضمين قوالب.
5. Sectioning
- 15 ميكرومتر تعد المقاطع من العين مضمن باستخدام مشراح.
- وضع العين على المقاطع شريحة المغلفة الجيلاتين وترك الأمر على الشريحة الأكثر دفئا.
6. تلطيخ
- مكان الشرائح في الزيلين لمدة 10 دقائق. أكرر مرة أخرى.
- في هيدرات : 100 ٪ ، 95 ٪ ، 80 ٪ ، 70 ٪ ، 30 ٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة لكل
- شطف في الماء لمدة دقيقة DI.
- يغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
- يغسل في PBST (0.2 ٪ تريتون - X 100 في برنامج تلفزيوني) لمدة 15 دقيقة.
- يغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
- مكان في عرقلة الحل (10 ٪ الضد الماعز الثانوية) لمدة ساعة.
- تحدث في جسم الأولية ليلة وضحاها.
- غسل جسم الأساسي في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
- يغسل في PBST لمدة 15 دقيقة.
- يغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
- مكان في الجسم المضاد الثانوي لمدة 2 ساعة في الظلام (1:100 التخفيف في برنامج تلفزيوني).
- يغسل في برنامج تلفزيوني ، PBST ، وبرنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة كل جبل والحين.
- مراقبة الشرائح تحت المجهر مضان.
7. ممثل النتائج :
هذا الإجراء من زراعة نيوت الأشعة تحت الحمراءوقد استخدمت الخلايا هي دراسة إمكانية تجديد الخلايا الظهرية والبطنية IPE. وعلاوة على ذلك ، فمن الممكن أيضا لدراسة الجينات المحددة التي تسهم في عدسة العين في آلية التجديد نيوت. عندما تم تربيتها في الخلايا لمدة 2 أسابيع يمكن (الشكل 1) يكون transfected من قبل لدراسة الجينات وظيفتها في التجدد العدسة. ذات أهمية خاصة هي الجينات التي قد حث قزحية البطني. منذ بطني خلايا قزحية لا يمكن transdifferentiate لعدسة (الشكل 2) أن تدرس وظيفة الجين الاستقرائي من مرشح. في الماضي ، وذلك باستخدام هذه التقنية أظهرنا أنه حين أعرب أكثر من ستة - 3 في وجود حمض الريتينويك تحريض عدسة وحظ من قزحية بطني 6. في الشكل (3) يمكننا أن نرى أن مجموع قزحية بطني أدت إلى عدسة نمت بشكل كامل والمتفاوتة (رأس السهم) ، لا تختلف عن العدسة المضيف من قزحية الظهرية (السهم).
الشكل 1. أ) مصطبغة قزحية الخلايا الظهارية الظهرية تربيتها في المختبر لمدة 2 اسابيع. ب) مصطبغة قزحية بطني الخلايا الظهارية المستزرعة في المختبر لمدة 2 اسابيع. علما بأن تصبغ استمرت هذه المرحلة في كل من خلايا قزحية ظهري وبطني.
الشكل 2. القدرة على تجديد الخلايا IPE مثقف. أ) الحث لنس من الظهرية التجميعية الخلية IPE (رأس السهم). استضافة تحريض من قزحية عدسة الظهرية (السهم) ، دي : قزحية الظهرية ، والسادس : قزحية بطني ، لو : عدسة ظهارة ، LF : ألياف العدسة. ب) عدم وجود تحريض من عدسة بطني التجميعية الخلية IPE (رأس السهم). استضافة تحريض من قزحية عدسة الظهرية (السهم).
الشكل 3. الاستقراء الكلي من عدسة بطني transfected مع 3 وستة وتعامل مع حمض الريتينويك. استضافة تحريض من قزحية عدسة الظهرية (السهم). الاستقراء الكلي من عدسة بطني (رأس السهم).
Discussion
وقد أنشأ هذا البروتوكول an في نظام المختبر لدراسة آليات التجديد في عدسة سمندل الماء. منذ المجاميع (الظهرية أو البطنية اتبع بإخلاص في السلوك المجراة خلال تجديد هذه التقنية يمكن أن تخفف من الجهد الهائل المطلوب لtransgenesis في سمندل الماء ويمكن استخدامها لتحقيق مكاسب من وظيفة ، فضلا عن فقدان وظيفة 7،8،9 من التجارب ، كما ويمكن ، بسهولة المجاميع أو القزحيات ككل أن يعامل مع عوامل النمو ودراسة آثارها على النحو المبين في هذا البروتوكول ، على سبيل المثال تمت دراسة دور الممر BMP باستخدام هذه التقنية 6.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة لمنح Ey10540 PAT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
- Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. Eye regeneration at the molecular age. Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).
- Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster. Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).
- Hayashi, T. Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration. Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).
- Grogg, M. W. BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration. Nature. 438, 858-862 (2005).
- Nakamura, K. miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking. PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).
- Madhavan, M. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).
- Maki, N. Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo. FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).
